[发明专利]一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法

权利要求书

1.一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，其特征在于，主要按照以下步骤进行：

第一步、构建Leptin基因过量表达载体

1) 用PCR 法扩增目的Leptin基因并对胶进行回收，并将Leptin片段连接到pMD18-T载体上，得到重组质粒pMD18-Leptin；

2) 酶切pIRES2-AcGFP1 载体和pMD18-Leptin 载体，利用胶回收试剂盒对所需的片段大小进行回收，将Leptin 连接到pIRES2-AcGFP1载体上，得到重组质粒pLeptin-IRES2-AcGFP1 ；

3) 采用试剂盒法制备无内毒素的质粒DNA，用于细胞转染，并对pLeptin-IRES2-AcGFP1载体进行回收和纯化，-20℃保存备用；

第二步、猪胎儿成纤维细胞转染、筛选

1) 利用组织消化法建立猪30日龄胎儿成纤维细胞系，冻存备用；

2) 复苏冻存备用的胎儿成纤维细胞系，进行G418毒性敏感性检测，得到10天内使细胞全部死亡的最适浓度为500ng/ul ；

3) 再次复苏细胞，待细胞汇合度达到80-90％时收集细胞并计数，将细胞用电击缓冲液重悬，并加入30ug leptin 过量表达载体pLeptin-IRES2-AcGFP1，移入电击杯中进行转染；

4) 电击完成后，将细胞悬液迅速转移到100mm 培养皿中进行培养，48h后收集细胞进行初步鉴定和极度稀释培养；

5) 根据步骤2)中得到的最适浓度，在极度稀释培养3天后换液，开始用加有适当浓度为500ng/ul的G418的含有10％ FBS的DMEM完全培养基进行培养，每隔3天换一次液，10d后能得到牛津杯大小单克隆点；

6) 在显微镜下用记号笔画出单克隆点的位置，胰酶消化法抠出单克隆点放入48孔板中进行培养，第二天换加有一半浓度G418的含有10％FBS 的DMEM 完全培养基进行培养，每天观察细胞生长状况，将长满的细胞进行详细编号并传代至另外一个48孔板，一份用于鉴定是否是阳性，一份用于扩大培养；

7) 待用于鉴定的细胞长满后，用胶原酶消化法收集细胞，提取细胞基因组DNA，通过PCR 鉴定是否是阳性,对鉴定出来的阳性细胞系进行扩大培养和冻存备用；

第三步、Leptin 细胞的核移植及胚胎移植

1) 受体卵母细胞的培养

a、从屠宰场采集猪的卵巢并在4h内运回实验室；

b、挑选直径为3-6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入TCM-199成熟培养液滴中，在5％CO₂，38.5℃的培养箱中培养38-42h；

2) 构建过量表达Leptin 基因的重构胚

a、取转入Leptin基因的成纤维细胞，用含有0.5％FBS的DMEM 培养48h, 使体细胞处于G₀或G₁期；

b、卵丘-卵母细胞复合体经体外成熟培养后，用0.1mg.mL^-1透明质酸去除卵母细胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0.5-1h，在操作液中用显微注射针将极体及其周围胞质一起吸去，然后将转Leptin 基因的成纤维体细胞导入到去核的卵母细胞的卵间隙中；

3) 电融合和电激活重构胚

再将每批20枚重构胚胎，移入融合液中清洗三遍，进行重构胚的电融合处理，完成后移入NCSU23 培养基中培养2h，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后进行电激活，重构胚移入含有2.2ug.mL^-1CB的培养液中后放入含有5％CO₂、5％O₂、38.5℃的三气培养箱中平衡2h；

4) 重构胚的体外培养

将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养至胚胎移植；

5) 将重构胚移植到自然发情的代孕母猪内继续发育，代孕母猪妊娠114天后获得转Leptin基因的克隆仔猪；

第四步、转Leptin基因克隆仔猪的过量表达验证

利用设计好的GFP引物和Leptin引物对转Leptin克隆仔猪的DNA 和RNA进行验证。