[发明专利]一种黑曲霉在制备β-呋喃果糖苷转移酶中的应用

权利要求书

1.一种黑曲霉在制备β-呋喃果糖苷转移酶中的应用，其特征在于，该菌株为黑曲霉(Aspergillusniger)FOS-0620，已于2012年9月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.6640。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以体积百分比5％～10％的接种量，将处于对数期生长的黑曲霉FOS-0620的菌悬液接种于发酵诱导培养基中，进行诱导发酵培养，将得到的培养液离心或过滤得菌泥，用无菌水清洗后再离心或过滤，冷冻干燥，得到黑曲霉菌体；

(2)在上述黑曲霉菌体中加入提酶缓冲液，使黑曲霉FOS-0620菌体浓度为5mg/mL～30mg/mL，加入蜗牛酶，混匀后进行菌体破壁，破壁后的菌液经离心后的上清液为β-呋喃果糖苷转移酶粗酶液，经分离纯化，得到β-呋喃果糖苷转移酶。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述诱导发酵培养的条件为30℃～40℃，100r/min～200r/min摇床培养，发酵时间为36h～72h。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵诱导培养基：按重量份计，蔗糖2～10份，酵母浸膏1～5份，玉米粉1～5份，NaNO₃0.1～0.5份，pH6.0～7.5，用蒸馏水定容至100份，灭菌后冷却即可。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述蜗牛酶的浓度为0.2mg/mL～0.8mg/mL。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述提酶缓冲液中含有胰蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇，其浓度分别为1μg/mL～3μg/mL和0.5μmol/mL～2.0μmol/mL。

7.根据权利要求2或3或4或5或6所述的应用，其特征在于，所述分离纯化的步骤如下：所述粗酶液经过高流速离子型琼脂糖凝胶阴离子交换层析柱和苯基-琼脂糖凝胶疏水亲和层析柱中的一种或两种层析，制得β-呋喃果糖苷转移酶。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，

所述阴离子交换层析是将粗酶液上样至阴离子交换层析柱上，先用不含NaCl的Tris-HCl缓冲液将层析柱洗至基线，再用含0mM～300mM的NaCl的Tris-HCl缓冲液进行NaCl梯度洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的β-呋喃果糖苷转移酶酶活，合并具有β-呋喃果糖苷转移酶的组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩；

所述疏水亲和层析是经阴离子交换层析后所得的β-呋喃果糖苷转移酶组分上样至疏水亲和层析柱上，先用含(NH₄)₂SO₄为25％的Tris-HCl缓冲液将层析柱洗至基线，再用含0％～25％(NH₄)₂SO₄的Tris-HCl缓冲液进行从高浓度到低浓度的梯度洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的β-呋喃果糖苷转移酶酶活，合并具有β-呋喃果糖苷转移酶的组分，透析除盐并用聚乙二醇20000浓缩。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，

所述Tris-HCl缓冲液的浓度为20mM～100mM，pH为7.0～7.5；

所述阴离子交换层析和疏水亲和层析中洗脱的流速分别为1mL/min和0.5mL/min。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述清洗和离心或过滤的操作至少重复1次；步骤(2)所述菌体破壁温度为30℃～40℃，破壁时间为2h～5h。