[发明专利]电穿孔装置及用其进行哺乳动物细胞电穿孔的方法

说明书

本发明涉及电穿孔装置及用其进行哺乳动物细胞电穿孔的方法。本发明涉及电穿孔装置和用该装置有效促进将生物分子导入身体特定组织(特别是皮肤例如真皮内或皮下组织)的细胞的方法。在某些方面，本发明是皮肤EP装置，其产生能量脉冲，用皮肤电极阵列将能量脉冲递送至皮肤组织，并基于使用者的输入在该皮肤组织维持恒定电流，包括预设定电流，并能够存储和获取电流波形数据。

本申请是国际申请日为2007年10月17日的国际申请PCT/US2007/02213 9进入中国、申请号为200780046652.7的题为“电穿孔装置及用其进行哺乳动物细胞电穿孔的方法”的发明专利申请的分案申请。

优先权声明

本申请要求2006年10月17日申请的临时申请美国序列 601852149号和2007年10月10日申请的美国序列601978982号的优先权。

技术领域

除其他内容外，在本发明涉及电穿孔装置和它们在辅助向所选哺乳动物组织优选皮肤中引入生物分子中的应用。

背景技术

哺乳动物皮肤或皮肤组织的特点为具有细胞层并分为不同的区域(见图1)。最表面的区域为表皮(1.1)，其可分为5个亚层：角质层(1.1.1)、棘层(1.1.2)、透明层(1.1.3)、颗粒层(1.1.4) 和基底层(1.1.5)。真皮(1.2)位于表皮之下，是血管化非常丰富的区域；毛根和汗腺均位于这一层。皮下层位于真皮之下。

皮肤已进化至不仅可作为物理屏障也可通过其在免疫系统中的功能发挥保护作用。作为宿主防御病原体的前线，皮肤有足够的装备进行免疫监督。举例而言，与其他组织相比，皮肤的表皮包含大量的郎格罕细胞，其为非常强效的未成熟树突状细胞(“DC”)。因此，将抗原靶向皮肤真皮可有效诱导强免疫应答。但是，表皮(1.1) (见图1)的角质层(1.1.1)建立的屏障倾向于阻止抗原至表皮的有效进入。树突状细胞是皮肤中的主要抗原递呈细胞。皮肤中大量种群的DC使真皮内(intradermic，“ID”)免疫称为具有吸引力的途径。

体内质粒转移技术，尤其是当其涉及转移质粒至真皮内 (“ID”)或皮下(“SQ”)组织或细胞，已传统地受到局限，因为裸露DNA(质粒)转移引起的体内表达水平一直较低，仅有部分是通过病毒基因转移完成。与可用于肌肉内注射(“IM”)的剂量相比以适用于ID或SQ的体积给予的质粒剂量较小。许多研究均已表明对向动物和人注射病毒作为DNA载体的安全性和毒理学的关注 (Frederickson等，Mol.Ther.8：8-10(2003))。因此，直接注射质粒DNA 已成为期望的递送技术，然而，有效传送至细胞和蛋白表达水平是一大难题。骨骼肌细胞提供了直接质粒转移DNA疫苗和其他应用的主要靶标(Prud′homme等，Curr.GeneTher.6：243-273(2006))。

质粒体内递送的最近进展为电穿孔(“EP”)。EP可用于递送各种分子：从离子到药物、染料、示踪剂、抗体和寡聚核苷酸至 RNA和DNA(Gehl，Acta PhysiolScand.177：437-447(2003))。该方法将目标组织暴露于简单的电场脉冲下，其可诱导在细胞膜中形成瞬时和可逆的孔。在膜去稳定化过程中，分子例如质粒可进入细胞内。之前，报导已显示对EP方法的改良可增加转移效率并降低通过使用恒流装置体内产生目标水平抗原所需的质粒量(Draghia-Akli和Smith，Gene Therapy第245页-Therapeutic Mechanisms andStrategies，N.S. Templeton和D.D.Lasic编辑，MarcelDekker，Inc.，New York.(2003))。使用EP增强质粒传送使得被注射组织可用做大量生产和向血流中分泌蛋白质的生物反应器和/或用于抗原递呈。与单独质粒注射相比表达水平增加了二至三个数量级，增加至可与腺病毒介导的基因传送可比的水平并且在一些情况下可达到生理学范围。