[发明专利]一种基于抗甘胆酸特异性抗体的甘胆酸的免疫检测试剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫检测领域。具体而言涉及一种甘胆酸半抗原、以及使用该甘胆酸半抗原制备的抗体以及使用所制备抗体的免疫检测试剂。具体而言涉及一种甘胆酸时间分辨荧光免疫测试条，测试条所用的抗体是用合成的甘胆酸免疫原免疫小鼠制备的甘胆酸特异性单克隆抗体。

背景技术

甘胆酸(Cholyglycine,CG)是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一。在肝细胞内，胆固醇经过及其复杂的酶促反应，转变成初级胆汁酸，其中有胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CD-CA)胆酸、鹅脱氧胆酸(CDCA)和脱氧胆酸(DCA)等。胆酸的类固醇核上有三个羟基(C3、C7、C12)，侧链末端的羧基以肽键与甘氨酸结合，形成甘胆酸，分子量为465.63，结构如式1，

甘胆酸正常代谢途径为肠—肝循环，先由肝细胞合成，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆汁进入十二指肠，帮助食物消化。95％甘胆酸在回肠末端重吸收，经门静脉再回肝脏，由肝细胞摄取再利用。正常情况下，肝脏能有效摄取门静脉血中99％以上的甘胆酸，仅有1％甘胆酸进入体循环，因此外周血中甘胆酸含量甚微，正常成人无论空腹或餐后，其血清甘胆酸浓度稳定在低水平。

当肝细胞受损时，肝细胞摄取甘胆酸能力下降，致使血中甘胆酸含量增高；胆汁郁滞时，肝脏排泄胆酸发生障碍，而返流血液循环的甘胆酸含量增高，也使血甘胆酸含量增高。临床证明，各种肝脏疾病如：肝癌、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎等患者的甘胆酸水平均显著升高。大量研究表明，肝损伤的生化指标中甘胆酸比谷丙转氨酶，胆红素等传统的肝功能检验指标更敏感。甘胆酸结合其他指标的分析可以为肝脏疾病的诊断、治疗和预后分析提供更多的依据。此外，甘胆酸水平也是多种胆道系统疾病、妊娠期肝内胆汁淤积症及酒精性肝损伤等的重要诊断依据。因此，测定血清甘胆酸是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。

目前，体外定量测定甘胆酸主要是使用放射免疫分析法(RIA)，化学发光免疫分析法(CLIA)等。放射免疫分析法由于需要专门的放免实验室及设施，普通实验室难以开展，另外还会对操作人员的健康产生一定危害，目前已很少使用。化学发光法灵敏度高，但是测定速度较慢，且专用的化学发光检测仪器昂贵，不利于基层开展。

目前本领域需要制备特异性强、灵敏度高的抗甘胆酸特异性抗体，并用该抗体开发出快速、准确、高效、简便的甘胆酸检测试剂，而时间分辨免疫层析测试条，以其检测速度快、操作简单、灵敏度高等特点，已得到越来越多的关注。

发明内容：

为了解决现有甘胆酸临床诊断的不足，本发明的目的是提供一种快速、高效、简便、准确检测待测样本中甘胆酸含量的时间分辨免疫层析测试条及其制备方法。

本发明还提供一种新的甘胆酸免疫原合成方法，用该方法合成的甘胆酸免疫原免疫小鼠获取特异性和亲和力高的单克隆抗体，以及使用所获得的单克隆抗体的时间分辨层析测试条。

具体而言，本发明涉及一种甘胆酸半抗原，其结构式如式1，

其中R为－(CH2)n－，n为2-8的任意整数，载体蛋白为牛血清白蛋白或者人血清白蛋白。

此外，本发明还涉及由上述甘胆酸半抗原制备的抗体。可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，尤其是由所述半抗原免疫小鼠得到的单克隆抗体。

再次，本发明还涉及一种检测甘胆酸的测试条，包括：

底板，样品垫，结合物释放垫，反应膜，吸水纸；

其中在背板上依次放置样品垫、结合物释放垫、反应膜和吸水纸，并且样品垫与结合物释放垫的一侧有部分重叠，但样品垫与反应膜不重叠；结合物释放垫另一侧与反应膜的一侧部分重叠，但结合物释放垫与吸水纸不重叠；反应膜的另一侧与吸水纸部分重叠；并且在反应膜上从与结合物释放垫部分重叠一侧至与吸水纸部分重叠一侧依次划有结核抗原检测线和质控线，并且检测线和质控线均不与结合物释放垫和吸水纸重叠；

并且其中与抗甘胆酸特异性单克隆抗体偶联的时间分辨荧光纳米粒子位于结合物释放垫中。反应膜上的检测线为卵清蛋白、血清白蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白与甘胆酸衍生物偶联物，上述的甘胆酸衍生物如下式2所示，

其中R为－(CH₂)n－，n为2-8的任意整数。

在所述测试条中，所述抗甘胆酸的特异性抗体可以是抗甘胆酸多克隆抗体或者单克隆抗体，尤其由所述半抗原免疫小鼠得到的单克隆抗体。