[发明专利]一种靶向抗肿瘤活性蛋白及其制备与纯化

说明书

本发明提供了一种靶向抗肿瘤活性蛋白及其制备与纯化。化学合成葡萄糖调节蛋白78(GRP78)结合肽段(GBP)和亚麻酶胞毒素A亚基(SubA)的基因序列，将这两个序列通过限制性内切酶位点融合连接到pET‑28a载体上，获得重组子pET‑28a‑GBP‑SubA。将该重组子转化到大肠杆菌Rossate中，筛选获得工程菌pET‑28a‑GBP‑SubA/Rossate。将该工程菌接种到含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养，经IPTG诱导表达，收集菌体，分离纯化获得目的蛋白GBP‑SubA。该蛋白可有效促进膜表面GRP78高表达的肿瘤细胞的凋亡，对正常细胞无作用，可在制备靶向抗肿瘤药物中应用。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种靶向抗肿瘤的亚麻酶胞毒素及其制备方法和该毒素蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

技术背景

葡萄糖调节蛋白78(GRP78)也称免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)，属于热休克蛋白70(HSP70)家族成员。由于其N-端的信号肽序列，GRP78蛋白可定位于内质网(ER)中发挥分子伴侣的功能，帮助蛋白正确折叠与装配，参与错误折叠蛋白降解、内质网Ca²⁺结合和内质网应激信号等的调控。

随后的研究发现GRP78与肿瘤的发生发展密切相关。GRP78在肿瘤组织中的表达通常高于癌旁组织，并且GRP78随着肿瘤的恶性程度的升高，其表达量也逐渐升高，同时高表达的GRP78参与了肿瘤细胞的增殖、迁移、耐药等恶性转化过程。在肝癌细胞中过表达GRP78后，可明显促进肝癌细胞的迁移及浸润；在乳腺癌细胞中，GRP78的高表达可以明显提高癌细胞的耐药性。因此GRP78的促癌效应越来越受到人们的重视。更值得关注的是，GRP78蛋白在肿瘤细胞中的定位并不局限于内质网，它可以特异的存在并聚集于肿瘤细胞的表面，并且随着肿瘤恶性程度的升高，膜表面GRP78的量也逐渐升高，而在正常细胞的膜表面几乎检测不到GRP78，这一特性使得GRP78非常适合作为肿瘤靶向治疗的靶标。因此如果能综合利用GRP78的这两个特性，将肿瘤细胞膜表面高表达的GRP78作为区别于正常细胞的特异性靶标，把抗癌药物导入细胞内，干扰肿瘤细胞中GRP78的表达，则对肿瘤患者的治疗是非常有效的，但到目前为止，这种特异性的药物一直没有出现。

2006年Adrienne W.Paton等人首次发现，从出血性大肠杆菌中分离的一种亚麻酶胞毒素的A亚基(SubA)可以在GRP78的416和417位亮氨酸之间产生特异性的剪切，从而将GRP78蛋白的底物结合结构域和ATP结合结构域分开，使其失去功能活性，这一发现使得针对GRP78的抗肿瘤研究逐渐兴起。随后在2009年，Joseph M.Backer等人将表皮生长因子(EGF)与SubA连接形成融合蛋白，计划利用表皮生长因子受体(EGFR)在肿瘤细胞表面高表达的特性，使EGF-SubA特异的导向肿瘤细胞，从而实现靶向效应，但是这一融合蛋白有较大的副作用。首先，EGFR介导的信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用，因此其广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面；其次，EGFR与人体不同阶段不同器官的发育有着密切的联系，在婴幼儿和青少年的发育阶段以及卵母细胞和精原细胞成熟过程中EGFR的表达量也较高，所以EGF-SubA在杀死肿瘤细胞的同时对正常细胞的副作用也较大，限制了其大范围的应用。

另有研究通过噬菌体展示技术发现，某些多肽片段(例如：WIFPWIQL)可以与肿瘤细胞表面的GRP78特异结合并且可以通过GRP78内化进入细胞内部。因此，本发明将GRP78结合肽(GBP)和SubA连接形成GBP-SubA融合蛋白，GBP可以识别并结合特异存在于肿瘤细胞表面的GRP78，内化的SubA破坏肿瘤细胞内GRP78的功能，起到靶向抗肿瘤的作用。GBP-SubA融合蛋白特异针对GRP78高表达的肿瘤细胞，尤其对于恶性程度较高的肿瘤细胞具有更强的靶向性，在有效控制用药剂量的前提下，几乎不存在副作用，具有成为理想靶向抗癌药物的潜力。

发明内容