[发明专利]利用实时细胞分析系统检测γδT细胞对肿瘤细胞杀伤效果的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及利用实时细胞分析系统检测γδT细胞对肿瘤细胞杀伤效果的方法。

背景技术

γδT细胞是一类近年来才被发现的T淋巴细胞亚群，约占正常人外周血T淋巴细胞总数的1%～10%，人γδT细胞有两个主要的亚群，即Vδ1T和Vδ2T细胞。Vδ1T细胞主要分布在人上皮组织中，Vδ2T细胞主要分布在人外周血中。Vγ9Vδ2T细胞占外周血γδT细胞的90%以上。随着对γδT细胞结构和功能研究的不断深入，人们发现γδT细胞除可直接识别蛋白质和肽类抗原以及非肽类抗原而不需要MHC分子提呈，并且具有抗原提呈细胞的一些特征，此外还能通过细胞接触和分泌的细胞因子起免疫调节作用。

γδT细胞在机体肿瘤免疫过程中发挥重要作用。研究显示肿瘤患者外周血中Vγ9Vδ2T细胞的绝对数量及其产生INF-γ、TNF-α的能力与健康者相比均明显下降。另一项研究表明，将可以刺激Vγ9Vδ2T增殖的白介素-2（IL-2）和氨基双磷酸盐化合物注射到转移瘤患者体内后，患者肿瘤体积明显减小。因此，γδT细胞过继免疫治疗有着良好的前景。

在临床应用中，使用免疫细胞进行免疫过继治疗肿瘤前应对其细胞毒效应进行严格的检测或评价。目前常用的评价γδT细胞的细胞毒效应的方法有MTT法、LDH法、时间分辨荧光免疫分析法等，但这些方法由于不进行实时、连续监控，因此细胞状态的不同，操作手法的差异均可能造成误差，从而引发对结果的误判。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供利用实时细胞分析系统检测γδT细胞对肿瘤细胞杀伤效果的方法的技术方案。

所述的利用实时细胞分析系统检测γδT细胞对肿瘤细胞杀伤效果的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）E-plate检测板中每孔加入等体积培养液，将E-plate检测板至于37℃条件下孵育0.5-1小时后，测定其背景阻抗值；

2）取对数期的肿瘤细胞接种于E-plate孔板中，实时监测细胞生长；

3）待肿瘤细胞进入对数生长期后，根据实时监控所得参数，挑选细胞生长状况一致的板孔按不同的效靶比加入γδT细胞；

4）继续进行实时监控，待空白对照组肿瘤细胞进入凋亡期后终止实验；

5）利用系统自带软件分析γδT对肿瘤细胞的杀伤效果。

所述的利用实时细胞分析系统检测γδT细胞对肿瘤细胞杀伤效果的方法，其特征在于所述的步骤1）中每孔加入培养液体积为50-150μl。

所述的利用实时细胞分析系统检测γδT细胞对肿瘤细胞杀伤效果的方法，其特征在于所述的步骤2）中每孔加入肿瘤细胞悬液50-150μl，其中包含细胞数量为4000-12000。

所述的利用实时细胞分析系统检测γδT细胞对肿瘤细胞杀伤效果的方法，其特征在于所述的步骤2）实时监控细胞生长时间为18-48小时。

所述的利用实时细胞分析系统检测γδT细胞对肿瘤细胞杀伤效果的方法，其特征在于所述的不同板孔中所加的γδT体积相同。

本发明的有益效果：本发明提供了一种灵敏度高、稳定性好、可实时、无标记、连续动态地检测γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤效果的方法。

附图说明

图1为实施例1中不同效靶比γδT细胞对A549细胞的杀伤效果图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1

1）在37℃，5%CO₂环境中培养A549细胞至对数生长期；

2）在E-plate检测板中每孔加入95μl1640培养液，将E-plate检测板至于在37℃条件下孵育0.5小时后，测定其背景阻抗值；

3）取适量对数期A549细胞稀释至50000cells/ml，每孔接种100μl细胞悬液，实时监测细胞生长；

4）24小时后，根据细胞生长指数可判断细胞是否进入对数期，当细胞进入对数期后，挑选细胞生长状况一致的板孔按不同的效靶比每孔加入5μl不同浓度的γδT细胞；

5）继续进行实时监控，待空白对照组细胞进入凋亡期后终止实验。

利用系统自带软件分析γδT对杀伤肿瘤细胞的杀伤效果（图1，表1）。

表1.不同效靶比γδT细胞对A549细胞的生长抑制作用

上述实施例中步骤2）中每孔加入培养液体积为50μl或150μl；步骤3）中每孔加入肿瘤细胞悬液50μl或150μl，其中包含细胞数量为4000或12000，最后也能达到与实施例1相同的技术效果。