[发明专利]一种菊粉酶突变体发酵生产低聚果糖的方法

说明书

本法发明公布了一种利用菊粉酶突变体发酵生产低聚果糖的方法，所述生产高品质低聚果糖的酶解工艺包括最优的菊芋添加量，pH，缓冲液浓度，酶的添加量，温度，搅拌速度和反应时间。所形成的酶解工艺可以实现低聚果糖占总糖含量达95.78％以上的高效生产过程。本发明所述使用的菊粉酶是一种新型的菊粉酶突变体，具有较高的酶活，30m³体系下发酵液酶活达60000U/mL，可显著提高菊粉酶的生产效率，降低生产成本。本发明形成的低聚果糖的酶解工艺是一种新工艺，采用该工艺制备低聚果糖可以大大降低操作难度，节约经济成本。

技术领域：

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种菊粉酶发酵生产低聚果糖的方法。

背景技术：

低聚果糖(Fructooligosaccharides)，简称FOS，又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖,分子式为:G-F-Fn，n＝1～3(G为葡萄糖，F为果糖)。它是由β-D-果糖基通过β-2,1糖苷键连接而成的直链低聚糖。目前，工业上生产低聚果糖的两种方法，酶法转化蔗糖合成的蔗果低聚糖和由菊粉部分水解得到的全果糖低聚糖。二者在结构上稍有不同，但生理功能基本一样。都具有很多对人体有益的功能，如它热量低，促进矿物质吸收，不引起龋齿，降血脂，润肠通便，是双歧杆菌的增殖因子等，不易引起血糖波动，作为糖尿病人甜味剂等，被誉为营养、保健、疗效三位一体的21世纪健康新糖原。所以低聚果糖的工业化生产对促进我国低聚果糖研究和国民经济发展具有重要的意义。

菊粉(Inulin)又称菊糖，主要来源于菊芋、菊苣等植物，是由D-呋喃果糖分子经β-2,1糖苷键脱水聚合而成的线性直链多糖，其还原端含有一个葡萄糖残基，呈直链结构，聚合度通常在2～60，分子量为3000～5000碳单位，是一种功能性果聚糖和水溶性膳食纤维。菊粉作为一种纯天然的功能性食品配料，已被世界20多个国家批准为营养增补剂，广泛运用于乳制品、饮料、低脂低热量食品、焙烤食品、保健食品等。2009年，中国卫生部批准菊粉为新资源食品。

目前报道产菊粉酶的微生物包括鲁维酵母属、海洋酵母属、青霉属、曲霉属、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、节杆菌属、放线菌属等。但是通过野生型筛选、理化诱变和工艺条件优化的手段得到的菊粉酶普遍活力不高。基因工程手段是提高菊粉酶活性的有效途径之一。利用重组DNA技术菊粉酶基因酵母菌进行克隆和表达，实现菊粉酶的高效表达。目前国内江门量子高科、山东保龄宝、武汉盛世天元等单位生产低聚果糖所用的酶均来自国外少数几个酶制剂厂，进口价格昂贵。因此，菊粉酶制剂国产化对于低聚果糖的生产和应用显得非常重要。

酶法转化蔗糖工业化大规模合成的蔗果低聚糖，反应的副产物葡萄糖是酶的抑制剂，反应进行不彻底，混合物中含有大量葡萄糖和蔗糖，低聚果糖占总量≤55％～60％(干基)，且工艺复杂、生产成本高。而本专利所涉及到的菊粉酶，可高效水解菊粉长链为低聚糖，还不增加单糖副产物，低聚果糖含量高达95.78％以上，工艺简单，是一种生产低聚果糖的新工艺。

发明内容：

本发明解决上述问题所采用的技术方案是，以新鲜菊芋为原料，灭酶打浆后浸提2-8h，收集清液，清液经碱处理、除杂并脱色后作为反应原液，调节pH 3.8～7.9，按每Kg菊芋添加菊粉酶650000～2000000U，控制温度在20～80℃，搅拌速度在50～200r/min的条件下反应4～12h，当低聚果糖最大聚合度降低到5时，停止反应，将水解物进行浓缩，干燥即为低聚果糖产品；

所述菊粉酶氨基酸序列如核苷酸序列表SEQ ID No.5所示。

所述菊粉酶是一种通过基因工程手段获得的酶活性显著提高的菊粉酶突变体，所述突变体是以黑曲霉NRRL3135总RNA为模板逆转录扩增出菊粉酶基因，经密码子优化后，继而利用易错PCR等体外分子定向进化技术，对菊粉酶基因inuI进行分子改良，并对获得的突变位点进行定点突变组合而得。目前报道的文献中，未有采用此方法来提高菊粉酶酶活。

本发明的有益效果如下：