[发明专利]估算烟草N导入片段右端长度的分子标记、引物及方法

权利要求书

1.一种估算烟草N导入片段右端长度的方法在选育烟草抗TMV品种和在烟草TMV抗病基因定位中的应用，其特征在于步骤如下：

以TN5.51引物对或TN5.34引物对为引物，以待检测的包含N导入片段的烟草基因组DNA为模板，进行PCR 扩增，扩增产物进行电泳检测，如扩增出对应大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在分子标记位置与抗病对照材料Coker176无差异；如没有扩增出对应大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Coker176短；所述分子标记为Seq ID No.1 或Seq ID No.2所示序列；其中，

当以所述的TN5.51引物对进行PCR 扩增，如果扩增出845bp大小的DNA片段，即Seq IDNo.1所示序列的分子标记，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置与抗病对照材料Coker176无差异；如没有扩增出845bp大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Coker176短；

当以所述的TN5.34引物对进行PCR 扩增，如果扩增出648bp大小的DNA片段，即Seq IDNo.2所示序列的分子标记，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置与抗病对照材料Coker176无差异；如没有扩增出648bp大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Coker176短；

所述的TN5.51引物对的序列如下：

TN5.51-F1：5’-ttcgggtttttagttcggttt-3’，

TN5.51-R1：5’-aggcaccatgtcacaaaaca-3’；

所述的TN5.34引物对的序列如下：

TN5.34-F1：5’-cactttggcctctcacacaa-3’，

TN5.34-R1：5’-aaacttgttcatagtctgcgaat-3’。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的PCR 的反应体系如下：

DNA模板50 ng/μL 2.5 μL，

10×PCR buffer 2.0 μL，

dNTPs 2.5mM 1.2 μL，

引物对中的引物10umol/μL 各1.5 μL，

Ex-Taq DNA酶5U/μL 0.3 μL，

ddH2O 余量，

总体积为20 μL。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的PCR反应程序：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。