[发明专利]一种用于检测绵羊肺腺瘤病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种用于检测绵羊肺腺瘤病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，所述试剂盒包 含OneStepRT-PCRbuffer、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQIDNO:1至SEQID NO:2的引物及SEQIDNO:3的探针引物的混合物，其特征在于所述序列SEQIDNO:1至SEQ IDNO:2的引物序列为：

SEQIDNO:1：上游引物GAGCTTGCGTGCCGTATCCAT

SEQIDNO:2：下游引物CGCAAGCCGTAACAGCAGTAGC

根据权利要求1所述的一种用于检测绵羊肺腺瘤病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR试 剂盒，其特征在于所述探针引物序列为：

SEQIDNO:3：ATGTTGATACAAGGCCATATGGAAATAACGCTGTC。

2.根据权利要求1所述的绵羊肺腺瘤病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，其特征 在于所述引物混合物扩增出的条带序列为：

SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的由5’端向3’端延长的序列：

SEQIDNO:4：

gagcttgcgtgccgtatccattcatgttgatacaaggccatatggaaataacgctgtcattaaatatttatca tctaaac

tgttctaattgtatacttactaactgtattagaggagtagccaaaggagaacaagttatcatagtaaaacagc ctgcttt

tgtaatgctgcccgttgaaatagctgaagcatggtatgacgagactgctttagaattattacaacgtattaat acggctc

ttagccgtcctaagagaggcttgagcctaattatcctgggtatagtatctttaatcaccctaatagctactgc tgttacg

gcttgcg。

3.根据权利要求1、2或3所述的一种用于检测绵羊肺腺瘤病毒的TaqmanReal-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述引物浓度均为10pmol/μL，扩增引物及探针引物体积配比为 1:1:1。

4.根据权利要求1所述的一种用于检测绵羊肺腺瘤病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR 试剂盒，其特征在于所述阳性对照为构建的pGM-JSRV阳性质粒以及利用其倍比稀释后制作 为标准曲线。

5.一种如权利要求1所述检测绵羊肺腺瘤病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒的 使用方法，其特征在于采用实时荧光定量RT-PCR，包括以下步骤：

a.使用权利要求1所述的检测试剂盒进行RT-PCR扩增，条件如下：42℃反转录5min；94 ℃预变性2min；94℃20s，退火温度60℃30s，72℃20s，40个循环；

b.结果分析

根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35-40为可 疑，需重复检测。

6.再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性；也可以依扩增得到的Ct值根据 标准曲线对起始样品中病毒含量进行准确定量。

7.一种如权利要求6所述检测绵羊肺腺瘤病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒的 使用方法，其特征在于所述实时荧光定量RT-PCR的反应体系为：

a.OneStepRT-PCRbuffer：12.5份；

b.引物混合液3份；

c.酶混合物1份;

d.无RNA/DNA酶水5.5份；

e.提取样品的RNA模板3份；

f.阳性对照pGM-JSRV阳性质粒3份；

g.阴性对照无RNA/DNA酶水3份。

8.根据权利要求7所述的一种用于检测绵羊肺腺瘤病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR 试剂盒，其特征在于所述反应体系中的引物混合液3份为引物浓度为10pmol/μl的三条引物 混合液，其中JSRV上游引物1份，JSRV下游引物1份，探针引物1份。