[发明专利]一种用于检测猪瘟病毒流行株的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪瘟病毒检测技术领域，具体说是一种用于检测猪瘟流行株病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，本发明还包括该试剂盒的使用方法。

背景技术

猪瘟(Classicalswinefever,CSF)是由猪瘟病毒(Hogcholeralapinizedvirus，HCLV)或Classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一种高度接触性传染病，是危害养猪业最严重的传染病之一。世界动物卫生组织(OIE)将其列入OIE名录，我国将其列为一类传染病。近年来，我国猪瘟的流行和发病特点发生了很大的变化，在临床表现上趋于非典型化，主要表现为隐性带毒和慢性感染，成为影响养猪业发展的一大隐患。石门株是1945年在我国分离到的强毒流行株，也是我国攻毒用的标准强毒株，与兔化弱毒株同属于1.1亚型，这2株病毒的核苷酸和氨基酸具有很高的同源性。但是猪瘟弱毒疫苗在中国的大规模应用使猪瘟流行毒感染和疫苗接种的区分变得非常困难。另外，母源抗体干扰和免疫程序错误导致的免疫耐受也会引起CSF爆发。因此，急需建立一种可以准确诊断猪瘟流行毒株感染与疫苗接种的敏感、特异、重复性好的检测方法。

目前，用于检测猪瘟病毒的方法有多种，如病毒的分离鉴定、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和血清中和试验(SN)、免疫胶体金技术、反转录－聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR和基因探针等。荧光定量PCR方法是近年来迅速发展起来的一种分子生物学方法，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、自动化程序高、定量检测微生物核酸拷贝数等优点。但是上述方法都是通用型的，只能检测是否CSFV感染，无法区分检测到的毒株是疫苗株，还是田间流行毒株感染引起，另外，这些方法都存在或操作复杂或敏感性低或漏检、假阳性等问题。导致接种疫苗存在盲目性，进而加大了预防和监测CSFV的难度。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服目前国内市面缺乏用于准确鉴别诊断猪瘟流行毒感染与疫苗接种的特异性检测的技术手段的难题，提供一种能够快速、敏感、准确以及低成本的用于检测猪瘟病毒流行株的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，本发明还提供该试剂盒的使用方法，本试剂盒及使用方法还适用于检测低微含量的猪瘟病毒流行株病毒。

为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：

一种用于检测猪瘟流行株病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，所述试剂盒包含OneStepRT-PCRbuffer、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的引物及SEQIDNO:3的探针引物的混合物。

所述序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的引物混合物包括：

SEQIDNO:1：上游引物GGACCCTATTGTAGATAACACTAATTTTT

SEQIDNO:2：下游引物TTACCTTAGTCCAACTGTGGACGT

探针引物序列为：

SEQIDNO:3：ATTTATTTAGGTATTACTATTTATTTATTTATTTATTTATTGAATGAG

所述探针引物的5’端标记物为FAM报告荧光基团、3’端标记物为TAMRA淬灭荧光基团。

SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的由5’端向3’端延长的序列：

SEQIDNO:4(180bp)：

ggaccctattgtagataacactaatttttatttatttaggtattactatttatttatttatttatttattgaatgagtaagaactggtacaaactacctcaagttaccacactacactcatttttaacagcactttagctggaaggaaaattcctgacgtccacagttggactaaggtaa。

所述阴性对照为无RNA酶水。

所述阳性对照为含有猪瘟流行株基因序列的阳性质粒pGM-180，其构建方式如下：

a.猪瘟流行株基因组RNA的提取按QIAGENRNeasyMiniKit说明书进行操作。以提取的病毒RNA为模版进行反转录合成cDNA。以SEQIDNO:1及SEQIDNO:2作为引物扩增，反应条件为94℃预变性5min；94℃变性50s,51℃退火40s,72℃延伸50s,共30个循环；72℃再延伸8min，4℃5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。