[发明专利]一种检测亲水支架上细胞培养状态的方法

权利要求书

1.一种检测亲水支架上细胞培养状态的方法，包括：步骤a、以2倍于亲水支架体积的磷酸缓冲盐溶液浸泡所述亲水支架过夜，再用磷酸缓冲盐溶液清洗所述亲水支架2～3次；

将待检测细胞接种到所述亲水支架上进行培养，接种密度为1.8×10⁵-2.2×10⁵个细胞/毫升，至所述待检测细胞在所述亲水支架上的生长融合率为90％-95％时，获得支架-细胞复合体系；

所述亲水支架为魔芋葡甘聚糖微球支架；

所述待检测细胞为SD大鼠骨髓间充质干细胞；

所述支架-细胞复合体系为魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系；

步骤b、采用吖啶橙染色液对所述魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系进行荧光染色，所述吖啶橙染色液为浓度为0.8-1.2mg/ml的吖啶橙乙醇溶液，包括：

用1ml微量移液器将所述魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系移入激光扫描共聚焦显微镜专用培养皿内，弃去上层清液，并用磷酸缓冲盐溶液反复清洗3次，然后用1ml磷酸缓冲盐溶液使所述魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系悬浮，形成魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系悬浮液；

每1ml所述魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系悬浮液中加入1ul所述吖啶橙染色液，然后孵育10分钟，弃去上层清液；

再次用磷酸缓冲盐溶液清洗三次后，用1ml无血清a-DMEM培养基重新悬浮魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系，得到用吖啶橙染色后的魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系；

步骤c、将染色后的所述魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系置于激光扫描共聚焦显微镜下，并利用绿色荧光通道和橙色荧光通道进行观察，从而检测得到所述魔芋葡甘聚糖微球支架上所述SD大鼠骨髓间充质干细胞的培养状态；

所述绿色荧光通道使用的激发光的波长为515-545nm，所述橙色荧光通道使用的激发光的波长为590-620nm；

采用所述激光扫描共聚焦显微镜进行观察的过程中，沿Z轴方向每隔0.8-1.2μm对所述魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系进行一次断层扫描，待断层扫描完成后，将全部断层扫描图像按Z轴方向上的顺序叠加，获得所述SD大鼠骨髓间充质干细胞在所述魔芋葡甘聚糖微球支架上三维状态；

采用所述激光扫描共聚焦显微镜观察洗涤后的魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系时，使所述魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系悬浮在无血清的DMEM培养基中。