[发明专利]一种抗龋齿菌抗体的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于医学技术领域，具体是一种龋齿抗体的制备方法。

背景技术

变异链球菌被公认为是龋齿主要的致龋菌。目前对变异链球菌进行被动免疫的措施有两种，一是将单一的或混合的变异链球菌菌体蛋白作抗原，免疫马牛羊兔等哺乳类动物，从动物血清中提取抗体，进行被动免疫防龋；二是将变异链球菌菌体中的葡糖基转移酶作为抗原，免疫脯乳类动物，从血清中提取抗体，进行被动免疫防龋。但现有的抗体制备技术存在以下问题：（1）抗体制备成本过高，特别是用葡糖基转移酶作抗原时，抗原提取困难；（2）抗体的效价较低，现有制备技术抗体效价最高也只有1:320。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗龋齿菌抗体IgG的制备方法，使抗体的生产成本降低，抗体效价提高。本发明的另一目的，是抗龋齿菌抗体IgG的应用，提供以本发明制备的抗变异链球菌抗体IgG和抗菌剂作为有效成份的防止龋齿的组合物。

采用的技术方案是：

一种抗龋齿菌抗体的制备方法，包括下述步骤：

1、取c型和d型两种变异链球菌，分别在BHI培养基或TTY培养基中培养2-3天；将培养好的两种变异链球菌分别进行离心处理，收集菌体，用pH值为6-7、浓度为0.05-0.2M的磷酸缓冲生理盐水洗菌体4-6次，50-65℃的温度下，加热25-35分钟，进行热处理，得到c型变异链球菌液和d型变异链球菌液。

将c型变异链球菌液和d型变异链球菌液，按1-2:1的比例混合，并加入与上述两液体之总量等量的福氏佐剂，用高速匀浆器处理，制得菌体抗原。

c型变异链球菌液，d型变异链球菌液和其它型菌液的混合比例最好为1：1：1。

每次取本发明的变异链球菌抗原1.0ml，对脯乳类动物进行淋巴结和背部皮下多点注射，注射三次，每隔三周一次；经检测效价合格后采集血清。取免疫血清搅拌下加入适量盐水稀释，调节pH值至7.5-8.5，加入等量饱和硫酸铵溶液，在2-8℃温度下静置20-30小时，高速离心20-30分钟，取其沉淀，经复融超滤浓缩除盐、除菌后冷冻干燥，即得抗龋齿菌抗体IgG粗提物（粗品）。

3、将抗龋齿菌抗体IgG粗提物离心纯化，离心纯化速度为5000-2500rpm，离心次数为2-5次，再经DEAE-SephadexA50层析柱层析。用含0.03-0.1MNaCl的磷酸缓冲液进行连续或分段梯度洗脱，洗脱液磷酸缓冲液浓度为0.003-0.02M。再用凝胶过滤柱层析洗脱液磷酸缓冲液浓度为0.01-0.2M，所含NaCl的浓度为0.1-0.5M。亲和层析洗脱液浓度为0.1-0.5M。

自动收集洗脱液；收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性；收集留取有抗体活性的蛋白洗脱液，调节蛋白含量为20mg/ml。

将前一步骤所得的蛋白洗脱液再经SephadexG200凝胶柱层析。用含0.05-0.2MNaCl的磷酸缓冲液进行连续或分段梯度洗脱，自动收集洗脱液；收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性；收集留取有抗体活性的蛋白洗脱液，0.22μ膜过滤除菌，冷冻干燥，即得抗龋齿菌抗体IgG纯品。

本发明制备的抗变异链球菌抗体IgG用于抗龋齿菌产品的添加量为每5-20g/Kg。其产品为以抗龋齿菌抗体IgG为有效成份的防龋齿的组合物。

本发明选择c型和d型变异链球菌作为抗原菌体，是基于以下研究结果考虑的。

变异链球菌按其血清分型，有a、b、c、d、e、f、g、h等血清型，但是对口腔中变异链球菌的检测表明，c型菌株约占60-90%，d型菌株约占10%，其它几种血清型菌的检出率很低。所以，c型和d型变异链球菌是引起龋齿的主要血清型菌，选择c型和d型变异链球菌作为主要抗原菌体，既避免了多种血清型混合菌作抗原时，主要血清型菌效用降低的问题；也避免了当单一血清型菌作抗原时，交叉免疫反应范围偏窄的问题。

另外，研究表明，从口腔变异链球菌的细胞壁提取出A和B蛋白抗原，其中c型变异链球菌的细胞壁含有A和B蛋白抗原，b型变异链球菌仅含有A蛋白抗原，a、d、e、f和g型变异链球菌则只含B蛋白抗原，所以，以c型菌和d型菌作为抗原，保证了抗体具有很大范围的交叉反应。

经检测表明本发明抗体IgG达到了PAGE纯，经分子量测定，抗体IgG分子量为160,000道尔顿。