[发明专利]一株减毒猪霍乱沙门氏菌及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一株减毒猪霍乱沙门氏菌S.Choleraesuis S1209，其特征在于，所述减毒猪霍乱沙门氏菌S.Choleraesuis S1209缺失wzx基因，分类命名为S.Choleraesuis S1209，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2015631，保藏时间为：2015年10月22日。本发明还提供了制备减毒猪霍乱沙门氏菌S.Choleraesuis S1209的方法及其在疫苗上的应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株减毒猪霍乱沙门氏菌及其制备方法和应用。

背景技术

随着新老传染病的不断流行，研究和开发有效防治传染病的方法显得极为迫切。在过去两百多年中，疫苗在防止细菌或病毒性传染病中发挥了巨大的作用。由于疫苗相对于大多数药物而言，具有使用成本低的优势，因此，不断的研究和开发疫苗是十分必要的。

在疫苗研究领域中，利用沙门氏菌作为载体已经得到了广泛的研究。然而，目前对沙门氏菌，特别是某种沙门氏菌(如猪霍乱沙门氏菌)的毒力基因，尚未完全研究清楚。在过去二十多年中，得到广泛认同的减毒沙门氏菌疫苗候选株为数不多，如营养缺陷型突变株(aroA、aroCD、purA)、压力反应缺陷株(htrA)、腺苷酸环化酶缺陷株(cya、crp)等。

造成有效的减毒菌株开发数量少并困扰研究人员的主要问题之一是：在众多已发现或可能的毒力基因中，并未得到哪些毒力基因一定适用于某类或某种减毒菌株的构建的确切认识。因而，对于具体某种细菌的减毒构建而言，需要进行大量实验确定相关的毒力因子，并寻求适用于该菌株的减毒构建方案。对于研究较少的细菌而言(如猪霍乱沙门氏菌)，减毒菌株的研究工作更显得十分困难。

在减毒猪霍乱沙门氏菌载体构建的研究领域中，有效的菌株主要为galE突变株、aroA突变株、cya/crp突变株、以及其它基于slyA、hilA等基因而构建的突变株。目前而言，对于是否还可以采取其它方法对猪霍乱沙门氏菌进行减毒构建，尚未十分清楚。因此亟待开发其它对猪霍乱沙门氏菌有效的减毒构建方法，以深化对减毒菌株构建乃至相关疫苗研究的认识。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一株减毒猪霍乱沙门氏菌S.Choleraesuis S1209，所述减毒猪霍乱沙门氏菌S.Choleraesuis S1209缺失wzx基因，分类命名为Salmonella Choleraesuis S1209，保藏于武汉市武昌珞珈山的中国典型培养物保藏中心(武汉大学)中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2015631，保藏时间为：2015年10月22日。

本发明的发明人经过大量的实验发现wzx基因与猪霍乱沙门氏菌的毒力具有较强关系，通过敲除其wzx基因可以获得减毒效果好的减毒菌株。原因可能在于wzx基因构成沙门氏菌O抗原LPS结构的翻转酶，而LPS结构对于沙门菌的毒力具有重要作用。

需要指出的是，目前对于哪些是猪霍乱沙门氏菌的主要毒力基因尚未建立确切的理论指导，在其它沙门氏菌或者其它需要进行减毒设计的菌种中行之有效的减毒方案，对于猪霍乱沙门氏菌而言并不奏效或效果较差。如本发明的一个实施例所示，当进行wzy基因、wbaB基因、wbaC基因、manB基因、manC基因缺失处理时，所得处理后的猪霍乱沙门氏菌菌株要么不具备减毒效果、要么减毒效果不理想。

如本发明的实验例所示，本发明所得菌株具有非常良好的减毒效果。

本发明对本领域的贡献之一在于，发现了wzx基因与猪霍乱沙门氏菌毒力的关系，并构建了一株减毒效果优秀的猪霍乱沙门氏菌。

本发明的第二个目的在于提供制备上述减毒猪霍乱沙门氏菌S.CholeraesuisS1209的方法，该方法包括如下步骤：

1)对wzx基因的上同源臂和下同源臂进行扩增；