[发明专利]BRCA1和BRCA2基因突变的多重PCR检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因突变检测领域，尤其涉及基因突变多重PCR检测。

背景技术

BRCA1和BRCA2是两个具有抑制恶性肿瘤发生的基因，在调节人体细胞的复制、遗传物质DNA损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用。已发现的BRCA1和BRCA2的突变有数百种之多，有些与遗传性乳腺癌和卵巢癌有关。总结BRCA1和BRCA2基因突变相关的癌症的终身风险显示，有BRCA1基因突变者患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50％-85％和15％-45％，有BRCA2基因突变者患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50％-85％和10％-20％。与普通妇女相比，这些都是很高的患癌几率。

由于BRCA1和BRCA2基因的突变对家族性乳腺癌、卵巢癌的发生有一定的联系，所以检测BRCA1和BRCA2的突变基因对相关癌症的诊断、预防和治疗有重要的临床意义。另外，由于BRCA1和BRCA2的突变众多，检测这些突变对于相关基因的研究十分有意义，例如对于基因多态性分析和家族进化史研究。

目前，普遍应用的BRCA基因突变检测方法主要为限制小片段长度多态性分析法(RFLP法)和DNA直接测序法。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法，该方法存在以下缺点：实验操作繁琐、检测周期长、成本高、存在第一轮酶切不完全导致的假阳性、非闭管操作、易于污染、难以满足临床检测要求。DNA直接测序法存在以下缺点：检测周期较长、成本高、非闭管操作、难以避免交叉污染、通量不高。另外，DNA直接测序的灵敏度较低，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据，通常需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法也难适用于临床检测。

也有已公开专利使用PCR方法来检测乳腺癌易感基因突变，例如专利“检测乳腺癌易感基因突变的多重PCR试剂盒及其制备方法”(授权公告号：CN101200766B)。但是，该专利所用的多重PCR仅限定在BRCA1和BRCA2基因部分外显子上的部分突变位点上，而这明显不能覆盖BRCA1和BRCA2基因遍布在多个外显子上的上百种突变，因此该专利在使用上有较大局限。

因此，本领域需要可用于高灵敏度、高通量、低成本检测BRCA1和BRCA2基因突变的方法和试剂盒。

发明内容

本发明的目的是为了提供可用于高灵敏度、高通量、低成本检测BRCA1和BRCA2突变的方法和试剂盒。本发明主要是利用多重PCR技术对BRCA1和BRCA2基因编码区进行捕获富集，然后通过高通量测序技术测定富集后的编码区序列，最终通过生物信息学分析高通量测序数据，从而发现编码区的突变情况及其频率。

因此，本发明提供了一种检测BRCA1和BRCA2突变的方法，所述方法包括

1)捕获：进行第一轮特异性多重PCR反应，使用189对引物对样品DNA进行扩增，所述189对PCR引物分两个试管进行反应，第一个试管引物95对(SEQIDNO.5-SEQIDNO.194)，第二个试管引物94对(SEQIDNO.195-SEQIDNO.382)，每个上游引物的5’端添加序列SEQIDNO.1：

“ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAC”，每个下游引物的5’端添加序列SEQIDNO.2：“GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTA”；

2)建库：进行第二轮PCR反应，使用PCR引物对：上游引物SEQIDNO.3：“AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC”，下游引物SEQIDNO.4：

“CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGTTGTGACTGGAGTTCAGACGT”对步骤1)获得的扩增产物进行扩增；

3)测序，对步骤2)获得的扩增产物进行测序；

4)分析，对步骤3)获得的测序结果进行分析，完成全编码区的突变检测。

本发明还提供了一种BRCA1和BRCA2基因突变多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：两套PCR引物和PCR扩增预混和溶液(例如，来自KAPA2GFast热启动多重扩增试剂盒)；