[发明专利]一种采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法

权利要求书

1.一种采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

(1)菌种培养

将保存的纳豆菌菌种进行活化，斜面培养的步骤，收集斜面培养的菌种加入到含有菌悬液的摇瓶中，镜检孢子数达到1×10⁸-1×10⁹/ml；

所述纳豆菌菌种为枯草芽孢杆菌菌株QR，其保藏号为CGMCC No.11274；

(2)空消

种子罐经消洗，检查后关闭所有与罐体连通的阀门，盖紧入孔，开三路蒸汽，打开蒸汽阀，排净空气，关闭排气阀，使罐压升至0.10-0.20mpa，打开所有与种子罐有关的小排气阀，排气20-40分钟，再关闭小排气阀，使罐压升至0.10-0.20mpa，然后全开排气阀，待罐压降至0时，打开入孔，排尽管内的冷凝水，关种子罐底阀门，准备进料；

(3)投料

关闭种子罐底出料阀，开启罐顶入料阀，关闭取样过滤器，冷却水进口；打开配料罐出口阀，输送泵入口，起泵，开启泵出口门上料；上料完毕停泵反吹料液管道，扫净料液管中残料；

所述种子罐中装填培养基，所述培养基由以下重量份数的组分组成：蛋白胨50-60份，磷酸二氢钾1-3份，硫酸铵1-5份，氯化钠1-5份，葡萄糖20-45份，硫酸镁1-2份，蔗糖10-30份，琼脂10-20份，去离子水500-800份；

(4)实消

按空消方式三路进蒸汽，开排气门，当罐压升至0.01-0.03mpa，调节蒸汽门，保持恒温打开所有罐顶通向外面的阀门，排气10-30分钟，关闭蒸汽，打开空气过滤器出口通入罐内，用牛皮纸包扎接种关口，关闭小排气阀，开启冷却水，使罐温降至35-37℃，关闭冷却水；

(5)接菌种悬浮液

将种子罐的压降至0，除去接种口上的盖帽，在火焰下将摇瓶种子倒入种子罐，拧紧种子罐接种口的盖帽，调整罐压至0.05-0.15mpa；

(6)移种

将种子罐底阀至分配站、发酵罐的管道灭菌，管道从发酵罐方通入0.1-0.2mpa无菌蒸汽，灭菌10-30分钟，打开所有管道上的小排气阀；灭菌完毕，打开发酵罐接种阀，通入无菌空气，关闭小排气阀，待管路冷却至接种温度30-35℃，升高种子罐压力至0.1-0.2mpa，切换分配站阀门，降低发酵罐压至0.02-0.04mpa，将种子液压入发酵罐；接种完毕，调罐压至0.05-0.15mpa，温度30-34℃，发酵周期150-180h，移种完毕，用蒸汽冲洗移种管线中的残料，关闭阀门；

所述发酵罐中装填发酵料，所述发酵料为水果、蔬菜、处理加工过的黄豆、处理加工过的红豆中的任意一种；

所述发酵料为水果时，所述水果经过去核或去皮，磨碎，115℃灭菌30min，降温至常温备用，所述水果为苹果；

所述发酵料为蔬菜时，所述蔬菜经过磨碎，115℃灭菌30min，降温至常温备用，所述蔬菜为土豆；

(7)放罐清洗

当pH达到7.0-7.5，终止发酵，停空气，停搅拌，打开出料阀，发酵液贮罐入料阀，利用压缩空气将料压至发酵液贮罐；料压净后，关闭出料阀，开排污阀，停压缩空气，当罐压为零时，打开入孔，用水清洗罐内所有装置，冲洗完毕通入空气，吹出CO₂；

(8)过滤

利用板框压缩，除去菌丝体，至过滤液透明无菌丝，残渣中杂质质量分数小于1％；

(9)低温冷冻干燥：

操作温度在-25℃至-30℃，操作时间为72小时-96小时；

(10)粉碎，分装，包装，储存。

2.根据权利要求1所述的采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，其特征在于，所述发酵料为处理加工过的黄豆时，处理加工过程为：选取黄豆清洗干净，浸泡24小时，磨碎，121℃高温灭菌60min，降温至常温备用。

3.根据权利要求1所述的采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，其特征在于，所述发酵料为处理加工过的红豆时，处理加工过程为：选取红豆清洗干净，浸泡36小时，磨碎，121℃高温灭菌60min，降温至常温备用。

4.根据权利要求1所述的采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，其特征在于，步骤(8)所述过滤的操作步骤为：

1)检查板框液压系统及装置，将合格滤布平整地铺在板框间；

2)启动液压泵，顶紧，压力控制在7-9Mpa；

3)将发酵液用泵输入板框，起泵时，掀开板框入料阀、回流阀，开贮罐口、泵入口，起泵；

4)过滤时，料液要始终保证温度恒定，搅拌不能停止，滤液要保证清晰透明,出料减慢时，证明滤渣已满，停止进料,罐渣吹干后将接收槽内料液排净，堵好出口，启动液压系统，退回板框，清理框内滤饼，洗好滤布，重新装好顶紧。