[发明专利]用于检测rs1800497的引物组合物、检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及引物组合物、检测试剂盒及检测方法，具体涉及用于检测rs1800497的A等位基因和G等位基因的引物组合物、基于前述两种引物组合物的检测试剂盒以及基于前述检测试剂盒的检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

多巴胺(Dopamine,DA)，是在人体大脑内含量最为丰富的儿茶酚胺类神经递质，可调控人体中枢神经系统中多种重要的神经内分泌功能，并且与多种神经精神类疾病(如精神分裂、帕金森病等)的发生密切相关。因此，近年来关于多巴胺的分泌调控及其受体编码基因的研究，一直是神经科学领域研究的焦点。

DA在进行神经内分泌功能调控作用时，主要通过其相应的膜受体来发挥功能。研究者们已成功分离出五种多巴胺受体(DA2R),根据受体的生物化学和药理学性质,可分为D1和D2两类受体。其中，D1类受体包括D1和D5两种类型，而D2类受体包括D2、D3和D4三种受体。

目前，多巴胺受体基因多态性与神经性精神病的相关性研究工作的重点主要集中在D2受体上，D2受体由位于11号染色体11q23.2的多巴胺受体D2(dopaminereceptorD2,DRD2)基因DRD2编码，与DRD2基因相邻的锚蛋白重复和激酶域1(ankyrinrepeatandkinasedomaincontaining1,ANKK1)基因近来同样受到了临床研究者们的关注。ANKK1基因与DRD2基因存在片段重叠和共享单倍型区域，其8号外显子上存在1个单核苷酸多态性位点(SNP)rs1800497(c.2317G>A，Glu713Lys)，又称DRD2Taq1A多态性。有证据显示，携带该SNP位点的等位基因可使大脑纹状体内的DRD2密度下降，携带DRD2rs1800497A等位基因的患者在应用第二代抗精神病药治疗期间静坐不能不良反应的发生率显著高于该位点GG基因型患者。所以CFDA发布的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》指出，“携带rs1800497A等位基因的患者应用第二代抗精神病药时静坐不能不良反应的发生风险增加，应注意。”

目前，研究者们测定类多巴胺D2受体的基因型时，采用的方法主要是PCR-RFLP法、测序法这两种。然而，这两种方法操作繁琐，需要反复开管操作，容易造成交叉污染，并且测序法需要依赖非常昂贵的进口设备及试剂，更加难以大规模推广。所以，开发一种价格低廉，并且操作简便，适合临床大范围普及推广的DBD2等位基因的基因检测试剂盒，对于神经精神类疾病患者临床药物检测方面的工作来讲，具有非常大的价值。

环介导的等温扩增(Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)是日本科学家于2000年提出的一种核酸恒温扩增技术，其主要特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下进行恒温扩增，仅需15-90分钟即可产生10⁹-10¹⁰数量级的产物。反应结束后通过肉眼直接观察体系状态的改变来判定待测样本的基因型，无需开管，因此大大简化了操作步骤，同时又可以有效避免样本交叉污染，而且，仅需普通水浴锅即可开展检测，又节约了大量的检测成本。

LAMP相对于其他以PCR为基础的检测手段而言，具有以下优越性：

(1)灵敏度高：LAMP扩增模板可低至6个拷贝，比传统PCR法高出1000倍，具有与实时TaqmanPCR同样的灵敏度；

(2)特异性好：LAMP反应需要针对待扩增模板6个区域设计4条引物，只有这4条引物都能完全与模板配对才能引发后续的扩增；

(3)操作简便、成本低廉：LAMP只需配置好反应体系并置于等温条件的水浴锅或者其他恒温设备即可，无需任何昂贵的设备仪器，大大降低检测成本；

(4)结果易于判定：LAMP反应的结果检测甚至无需电泳，只需通过肉眼直接观察扩增管的浊度或者反应体系的颜色变化来判定结果即可。

因此，LAMP是一种非常值得推广的检测手段。

本发明在LAMP的基础上，采用等位基因特异性环介导等温扩增(Allele-SpecificLAMP)技术，在特异性要求最为严格的F1c或者B1c的5’端(参照图1)，针对rs1800497的A等位基因和G等位基因设计特异引物以及检测用的组合物及方法，用于指导第二代抗精神病药的个体化用药。

发明内容