[发明专利]一种1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其DNA序列如SEQIDNO:2所示。

2.一种权利要求1所述的1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：1型鸭甲肝病毒VP0全基因的克隆：分析确定1型鸭甲肝病毒VP0全基因及酶切位点，根据Genbank登录号为JQ316452.1的DHAV-1X株全基因序列，设计扩增1型鸭甲肝病毒VP0基因DNA片段的特异性引物，同时在上下游引物的5’端分别添加上BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，提取1型鸭甲肝病毒的RNA，利用特异性引物进行RT-PCR扩增，得到1型鸭甲肝病毒VP0全基因的目的片段；

步骤二：构建重组表达载体pET-32a(+)/VP0：将1型鸭甲肝病毒VP0全基因的目的片段进行T克隆得到pMD18-T/VP0，分别培养含重组质粒pMD18-T/VP0和表达质粒pET-32a(+)的菌株，提取质粒，并用BamHⅠ和XhoⅠ对其进行双酶切，分析、回收、纯化后，将得到带有粘性末端的1型鸭甲肝病毒VP0全基因的目的片段与双酶切处理过表达质粒pET-32a(+)进行连接，将连接产物进行转化和鉴定；

步骤三：制备1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白：将重组表达载体pET-32a(+)/VP0转化到Ecoli.BL21表达宿主菌中，筛选，将筛选后的含重组表达载体pET-32a(+)/VP0的菌株经培养诱导表达，将表达产物经鉴定、纯化后，得到1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述特异性引物为：

上游引物P1：5’GGATCCGAAATGGATACTCTTACCAAAAAT3’，

下游引物P2：5’CTCGAGTCCCTGATTGTCAAATGGTC3’。

4.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二中1型鸭甲肝病毒VP0全基因的目的片段进行T克隆的方法为：将所述步骤一获得的1型鸭甲肝病毒VP0全基因的目的片段进行纯化回收，纯化产物末端加A，与pMD18-T载体连接得到连接产物，将所述连接产物转化至感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆，将得到的pMD18-T/VP0进行酶切鉴定。

5.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的连接反应体系为，带有粘性末端的1型鸭甲肝病毒VP0全基因的目的片段5.5μl，表达载体pET-32a(+)2μl，2×T₄DNALigaseMix7.5μl。瞬离，混匀，16℃连接过夜。

6.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白的诱导表达条件为：将重组表达载体pET-32a(+)/VP0转化到宿主菌BL21中，0.4mmol/LIPTG、37℃诱导6h。

7.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤三中纯化方法为Ni²⁺-NTA亲和层析纯化。

8.权利要求1所述的1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白用于作为检测1型鸭病毒性肝炎抗体的检测试剂。

9.一种用于检测1型鸭病毒性肝炎抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，包括ELISA板、PBST缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色液以及终止液，所述ELISA试剂盒还包括权利要求1所述的1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白，所述ELISA的反应条件为1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白作为抗原的包被浓度为1.67μg/ml，最佳包被条件为37℃1h转4℃过夜，血清稀释度为1：160，HRP标记的羊抗鸭IgG的释度为1：400，封闭液为5％的明胶，封闭时间为0.5h，显色时间为10min。

10.权利要求1所述的1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白，其特征在于，用于作为1型鸭病毒性肝炎的基因工程亚单位疫苗。