[发明专利]一种牙周膜干细胞的培养方法

权利要求书

1.一种牙周膜干细胞的培养方法，其特征在于，将牙周膜干细胞接种到水凝胶上，用含BMP-2的无血清培养基进行三维培养；

所述BMP-2的浓度为5-15ng/mL；

所述三维培养接种用的牙周膜干细胞在二维培养时，使用含bFGF的无血清培养基进行培养；

所述bFGF的浓度为5-15ng/mL；

包括以下步骤：

S1、牙周膜干细胞的分离及纯化

用I型胶原酶溶液消化牙周膜组织，获得牙周膜干细胞；用二维培养用无血清培养基培养牙周膜干细胞，至汇合度80％-90％，用胰蛋白酶溶液消化进行传代培养；

第一代细胞按照有限稀释法克隆化培养人牙周膜干细胞，待克隆长至汇合度30-60％时，用胰蛋白酶溶液消化细胞，进行扩大培养；

S2、三维培养

用胰蛋白酶溶液消化第3代细胞，接种至水凝胶上，用三维培养用无血清培养基进行三维培养；

所述二维培养用无血清培养基含有bFGF，所述三维培养用无血清培养基含有BMP-2。

2.根据权利要求1所述的牙周膜干细胞的培养方法，其特征在于，所述牙周膜干细胞的培养方法包括以下步骤：

S1、牙周膜干细胞的分离及纯化

刮取根中1/3牙周膜组织，剪碎后用10倍体积的1g/L-5g/L I型胶原酶溶液在37℃、200rpm条件下消化30-60min，加入等体积的完全培养基终止消化，1000-2000rpm离心5-10min，丢弃上清，用20-40mL PBS反复吹打离散细胞团块，用70μm的细胞筛网过滤，滤液1000-2000rpm离心5-10min，用二维培养用无血清培养基重悬沉淀；

按照(0.1～1)×10⁴/well将细胞悬液接种至培养板中，每孔加入2mL二维培养用无血清培养基，混匀后于37℃、5％CO₂、湿度95％的条件下培养，每3d换液1次，当汇合度80％-90％时，0.25％-0.125％胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养；

第一代细胞按照有限稀释法克隆化培养人牙周膜干细胞，调整原代细胞密度为10-100个细胞/mL，接种于培养板，用二维培养用无血清培养基于37℃、5％CO₂条件下培养，2d-5d换液1次，待克隆长至汇合度30-60％时，用0.125％-0.25％胰蛋白酶消化细胞，进行扩大培养；

S2、三维培养

将培养至第三代的牙周膜干细胞用0.1％-0.25％胰蛋白酶溶液消化，吸弃胰蛋白酶，用三维培养用无血清培养基重悬，用70μm细胞筛过滤细胞，以1000-2000rpm离心5-10min，收集细胞沉淀，并用三维培养用无血清培养基重悬细胞，以(0.1-1)×10⁸个细胞/mL的密度接种于5-15mg/mL的水凝胶材料上，加入三维培养用无血清培养，在37℃、5％CO₂中培养6-8天，每2-3天换半液。

3.根据权利要求1所述的牙周膜干细胞的培养方法，其特征在于，所述水凝胶为I型胶原水凝胶。

4.根据权利要求3所述的牙周膜干细胞的培养方法，其特征在于，所述I型胶原水凝胶通过以下方法制备：Ⅰ型胶原水凝胶溶液瞬时离心脱泡，接种到预先冷却的培养板内，-80℃静置2-4h后冻干12-20h。

5.根据权利要求4所述的牙周膜干细胞的培养方法，其特征在于，所述I型胶原水凝胶通过以下方法制备：将Ⅰ型胶原酸性溶液调节pH值至7.2左右，得到终浓度为5-15mg/mL的胶原水凝胶溶液；瞬时离心脱泡后接种到预先冷却的48孔板或96孔板内，-80℃静置3h后冻干16h。

6.根据权利要求1或2所述的牙周膜干细胞的培养方法，其特征在于，二维培养用无血清培养基组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物、5-15ng/mLbFGF、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，余量为UltraCULTURE Serum-freeMedium；三维培养用无血清培养基组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物和5-15ng/mL BMP-2，余量为UltraCULTURE Serum-free Medium。