[发明专利]小分子量透明质酸的制备方法与应用及透明质酸裂解酶基因载体和工程菌

权利要求书

1.透明质酸裂解酶基因载体，其特征在于：所述基因载体将长度为2208bp的hylb基因插入载体pET28a中，形成载体pET28a::hylb。

2.根据权利要求1所述的透明质酸裂解酶基因载体，其特征在于：所述hylb基因来源于兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)ATCC39920基因组；

所述hylb基因始于第128个氨基酸GCC，结束于终止密码子TAG，所述hylb基因序列如序列1所示。

3.利用权利要求1或2所述的透明质酸裂解酶基因载体制备得到的透明质酸裂解酶工程菌，其特征在于：将透明质酸裂解酶基因载体pET28a::hylb转入宿主菌，即获得透明质酸裂解酶工程菌。

4.根据权利要求3所述的透明质酸裂解酶工程菌，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)；所述诱导条件为在20-37℃的条件下，向培养基中加入0-1mMIPTG诱导过夜；优选在20℃的条件下，向培养基中加入0.1mMIPTG诱导过夜。

5.利用权利要求3所述的透明质酸裂解酶工程菌发酵制备透明质酸裂解酶的方法，其特征在于：按照下述步骤进行：

步骤1，将所述透明质酸裂解酶工程菌接种到LB培养基上，在37℃的条件下培养，得到菌液；

步骤2，将上述菌液转入离心杯中，4℃离心，收集菌体；

步骤3，将菌体置于预冷的PBS缓冲液中重悬，得到重悬后的菌体；

步骤4，用超声破碎仪破碎重悬后的菌体，得到破碎后的菌液；

步骤5，将上述破碎后的菌液，在4℃的条件下离心后，收集上清液，即得透明质酸裂解酶粗酶液。

6.根据权利要求5所述的透明质酸裂解酶的制备方法，其特征在于：在所述步骤3中，所述PBS缓冲液的体积比为5:1～10:1。

7.利用权利要求5所述的透明质酸裂解酶制备小分子量透明质酸的方法，其特征在于：按照下述步骤进行：

步骤1，底物配制：将野生型兽疫链球菌发酵后所得的发酵液经过处理提取得到大分子量的透明质酸，将干燥后的大分子量透明质酸用超纯水溶解，并控制浓度在2～3mg/ml,使其完全溶解，得到底物；

步骤2，酶解：将上述底物在37℃保温，并加入适量的透明质酸裂解酶，并反应一段时间后，即得降解后的透明质酸溶液；

步骤3，灭活：将上述降解后的透明质酸溶液用沸水煮沸1～2min，得到经过灭活的透明质酸溶液；

步骤4，过滤：将上述经过灭活的透明质酸溶液用0.45um滤膜过滤，除去杂质，得到经纯化的透明质酸溶液；

步骤5，沉淀：向上述经纯化的透明质酸溶液中加入3倍体积的无水乙醇沉淀，即得到小分子量透明质酸沉淀；

步骤6，冷冻干燥：将上述沉淀在-80℃条件下冷冻干燥，得到小分子量透明质酸成品。

8.根据权利要求7所述的小分子量透明质酸的制备方法，其特征在于：在所述步骤2中，所述透明质酸裂解酶的加入量为每1L底物加入46U～79U酶活力单位的透明质酸裂解酶。

9.根据权利要求7所述的小分子量透明质酸的制备方法，其特征在于：在所述步骤2中，所述酶解反应时间为0～6h。

10.利用权利要求7至9任一所述的小分子量透明质酸的制备方法制备得到的小分子量透明质酸在食品、化妆品或者医药领域的应用。