[发明专利]一种猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物病原菌分离技术领域，尤其涉及一种猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定方法。

背景技术

猕猴桃具有很高的营养及经济价值，是当今世界发展最为迅速的水果。我国是世界猕猴桃起源和分布中心，拥有丰富的猕猴桃种质资源，目前已超越新西兰及意大利成为世界猕猴桃栽培面积和产量最大的国家。猕猴桃产业对农民增收和产业结构调整具有重要意义。

猕猴桃溃疡病是一种由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.Actinidiae，简称Psa)引起的细菌性病害。该病自1983年在日本首次被发现以来，现已在新西兰、意大利、中国、法国、日本、伊朗、葡萄牙、智利和韩国等二十个国家中出现，并对全球猕猴桃产业造成了重大经济损失。目前，该病在我国的陕西、四川、湖南、贵州、江苏、浙江、广西和安徽等10个省份均已发生，仅2013年，感病面积已达到1828公顷，累计经济损失3.23亿元。

猕猴桃溃疡病菌主要借助风雨，或在修剪、绑枝等操作时借助操作工具，从植株的气孔、水孔、皮孔、伤口(虫伤、冻伤、刀伤)等处侵入，扩延至整个枝蔓及果园发病。在我国，该病一般在2月下旬至3月上旬开始发病，主干和枝条感病后龟裂，产生乳白色粘质菌脓；在3月中下旬至4月下旬，与植物伤流混合后呈黄褐色或锈红色，韧皮部局部溃疡腐烂。叶片上一般在4月份开始出现症状，在新生叶片上呈现不规则形或多角形、褐色斑点，后发展成病斑周围有3-5mm的黄色晕圈，叶片焦枯、卷曲。藤蔓上感病后，部分变成深绿色、水渍状，常形成1-3mm长的纵向裂缝。4月下旬到5月中旬，溃疡病菌开始侵染花蕾，花蕾感病后不能张开，变褐枯死后脱落。6月份至8月份，温度升高时，病原菌进入休眠期。9-11月，部分地区叶片和枝条上可能再次出现感病症状。12月至来年2月，病原菌主要在植株的皮孔、气孔及果柄处定植，也可随病残体在土壤中定植，侵染速度减弱；来年2月继续侵染，由此形成周年循环，严重时导致树体死亡(具体感病症状见图1)。

猕猴桃溃疡病的病原菌是丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(简称Psa)，是一种细菌性病害。由于猕猴桃细菌性溃疡病已被列入全国森林检疫对象名单，因此在最短的时间内快速检测外来或本地苗木上是否带有病原菌是防止该病扩散的有效手段，也是目前的重点研究方向。

猕猴桃溃疡病的诊断技术经历了从表面症状观察→菌落形态观察→显微镜检查→PCR快速检测4个阶段。PCR技术是20世纪80年代中期建立的一项体外迅速、大量扩增目的基因的技术，已广泛地应用于分子生物学、医学和农学等学科，用于基因的克隆遗传分析和疾病诊断等。由于PCR能够特异扩增某一DNA片段，因此，在病原微生物的检测上，比传统方法有优势，如PCR技术检测生物体时不需要培养，具有极高的灵敏度和快速等。近10多年来，PCR技术在植物病害检测中得到了广泛应用，也有不少学者对猕猴桃溃疡病菌(Psa)分子检测技术进行了研究，如2010年，Rees-George等基于rDNA的16-23S内转录间隔区(ITS序列)设计了1对猕猴桃溃疡病菌的特异性鉴定引物(PsaF1、PsaR2)，并将引物在与PSA病原菌亲缘关系较近的6个属17个种共计56个菌株进行了特异性扩增，进一步验证了引物的可靠性(Plantpathology,2010,59:453-464)。2011年，Marcelletti等运用通用引物对Psa及其他P.syringae菌株的7个持家基因gyrB、rpoB、rpoD、acnB、fruK、gltA及pgi序列进行了MLST分析，认为Psa菌株与P.syringaepv.theae亲缘关系最近(PLoSONE，2011，6：1-17)。

猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定，可以使我们尽快准确地确定样本中是否含有病原菌，防止病原菌的大规模传播，同时促进了该病原菌以DNA为基础的检测方法的发展。但目前，尚未有猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定方法的相关专利报道。

发明内容

本发明的目的是弥补现有技术的不足，提供一种猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定方法；本发明能在3天时间内实现猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定。

本发明的目的是这样实现的：首先，利用组织匀浆技术释放分离样本中的细菌，通过培养使其增殖，并运用高温裂解的方法获得样本的DNA；随后，基于特异性引物扩增是否出现条带，初步确定病原菌中是否含有Psa病原菌；最后，对意思病原菌的持家基因gltA进行测序，通过与NCBIBlast中进行序列比对确定该病原菌是否为Psa。

具体地说，本方法包括下列步骤：