[发明专利]一种快速检测土壤中病残体携带TMV方法

权利要求书

1.一种快速检测土壤中病残体携带TMV方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取土壤中病残体TMV总RNA；

(2)以提取的总RNA为模板，逆转录得到cDNA；

(3)以cDNA为模板，用以下两对引物进行LAMP扩增，得到扩增产物；第1对引物：

TMV-FIP5'-GCTGTGACTAACGGATCTAATACCG-AGGTTCCCTGACAGTGAC-3'

TMV-BIP5'-GAAGTTGAAAATCAGGCGAACCC-TGCGTCGTCTACTCTACG-3'第2对引物：

TMV-F3：5'-GGAAACCTTCACCACAAGT-3'

TMV-B3：5'-TATAGCGCTCCTTATGGC-3'

(4)用TAE电泳缓冲液配制2％琼脂糖凝胶，取5μLLAMP扩增产物在水平电泳槽中进行电泳，110V/100mA电泳35min，得到目标TMV的瀑布离散型条带。

2.根据权利要求1所述的快速检测土壤中病残体携带TMV方法，其特征在于：步骤A中所述的试剂盒使用，称取0.2g土壤样品代替说明书中的0.5g土壤样品。

3.根据权利要求1所述的快速检测土壤中病残体携带TMV方法，其特征在于：步骤(2)中所述的逆转录过程，根据TMV外壳蛋白设计一对引物的下游引物，代替通用引物oligDT。

4.根据权利要求1所述的快速检测土壤中病残体携带TMV方法，其特征在于：步骤(3)中所述的建立并优化LAMP体系，4μLFIP/BIP(10μM)，0.5μLF3/B3(10μM)，1.0μLMgSO₄(100μM)，1.0μLdNTPmix(10μM)，2.5μL10×PCRbuffer(Mg²⁺-free)，1.0μLBSTDNAploymerase(8U)，5.0μL反转录产物作为cDNA模板，其余用ddH₂O补充至25μL；反应程序为：62℃恒温水浴锅，恒温扩增反应1h，80℃反应10min，用来检测烟田土壤病残体中TMV。