[发明专利]一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其DNA序列如SEQIDNO:2所示。

2.一种权利要求1所述的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段克隆：分析确定鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因及酶切位点，根据Genbank登录号为JQ316452.1的DHAV-1X株全基因组序列，设计扩增鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段的特异性引物，同时在上下游引物的5’端分别添加上BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，提取鸭肝炎病毒RNA，利用特异性引物进行RT-PCR扩增，得到鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段；

步骤二：构建重组表达载体pGEX-4T-1/DHAV-MAg：将鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段进行T克隆得到pMD18-T/DHAV-MAg，分别培养含重组质粒pMD18-T/DHAV-MAg和表达质粒pGEX-4T-1的菌株，提取质粒，并用BamHⅠ和XhoⅠ对其进行双酶切，分析、回收、纯化后，将得到带有粘性末端的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段与双酶切处理过表达载体pGEX-4T-1进行连接，将连接产物进行转化和鉴定；

步骤三：制备鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白：将重组表达载体pGEX-4T-1/DHAV-MAg转化到Ecoli.BL21表达宿主菌中，筛选，将筛选后的含重组表达载体pGEX-4T-1/DHAV-MAg的菌株经培养诱导表达得到鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白粗品；将重组蛋白粗品鉴定、纯化后，得到纯化的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述特异性引物为：

上游引物P1：5’GGATCCACAACTACACAGACAATACT3’，

下游引物P2：5’CTCGAGGCCTAACACAATGACACAGAT3’。

4.根据权利要求2所述的一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤一中分析确定的方法为：对鸭肝炎病毒多聚蛋白进行生物信息学分析，选择抗原区域密集的多聚蛋白区域为DHAV-MAg基因。

5.根据权利要求2所述的一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二中鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段进行T克隆的方法为：将所述步骤一获得的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段进行纯化回收，纯化产物末端加A，与pMD18-T载体连接得到连接产物，将所述连接产物转化至感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆，将得到的pMD18-T/DHAV-MAg进行酶切鉴定。

6.根据权利要求2所述的一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的连接反应体系为，带有粘性末端的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因DNA片段5.5μl，表达载体pGEX-4T-12μl，2×T₄DNALigaseMix7.5μl。瞬离，混匀，16℃连接过夜。

7.根据权利要求2所述的一种鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白的诱导表达条件为：将重组表达载体pGEX-4T-1/DHAV-MAg转化到宿主菌BL21中，0.4mmol/LIPTG、37℃诱导12h；所述步骤三中纯化方法为切胶纯化。

8.权利要求1所述的鸭肝炎病毒多聚蛋白抗原密集区域DHAV-MAg基因重组蛋白应用于作为检测鸭病毒性肝炎抗体的检测试剂。