[发明专利]一种用于弓形虫病防治的可复制型RNA疫苗及构建方法和应用

权利要求书

1.一种用于弓形虫病防治的可复制型RNA疫苗，其特征在于：所述疫苗是将弓形虫抗原基因NTPase-II插入到甲病毒载体RREP上，获得重组质粒pRREP-NTPase-II，免疫前，将该重组质粒体外转录成RNA后，即可获得所述可复制型RNA疫苗；

所述NTPase-II是弓形虫的核苷三磷酸水解酶，与弓形虫的生存和繁殖有关，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

具体步骤如下：

以弓形虫RH株DNA作为模板，通过聚合酶链式反应扩增获得NTPase-II基因片段,并插入到甲病毒载体pRREP-EGFP的XmaI和SpeI位点间，替换EGFP基因，产生pRREP-NTPase-II重组质粒，重组质粒经PCR和测序鉴定，用质粒大提试剂盒大量提取质粒，凝胶电泳显示重组质粒的构建和鉴定，将质粒DNA以BspQI酶切线性化后，体外转录为RNA后对其进行加帽处理，即得可复制型RNA疫苗；

具体步骤如下：

⑴设计特异性引物：

根据弓形虫RH株NTPase-II基因序列，该基因序列去除信号肽，设计一对特异性引物NTPase-II上游引物和NTPase-II下游引物，在引物5’端分别引入XmaI和Spe I酶切位点，所述一对特异性引物的序列如下所示：

NTPase-II上游引物：SEQ ID NO.2；

NTPase-II下游引物：SEQ ID NO.3；

⑵NTPase-II基因扩增：

以弓形虫RH株DNA为模板，用KAPAHiFi高保真酶扩增NTPase-II基因，PCR反应体系和反应条件如下：

PCR反应条件：预变性95℃5min，变性98℃20s，退火60℃15s，延伸72℃1min，共32个循环，终延伸72℃2min；

取PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，获得预期大小1815bp的目的条带，剩余的PCR产物纯化回收，得NTPase-II片段；

⑶NTPase-II目的片段及载体的双酶切和回收：

NTPase-II片段和pRREP-EGFP载体用XmaI和Spe I进行双酶切37℃过夜，NTPase-II片段酶切产物纯化回收，得NTPase-II目的片段；pRREP-EGFP质粒酶切产物，经琼脂糖凝胶电泳分离，获得10749bp的pRREP大片段和720bp的EGFP片段，回收其大片段，得pRREP载体；

⑷NTPase-II目的片段与载体的连接与转化：

将回收得到的NTPase-II目的片段与pRREP载体用T4DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，得连接产物，然后将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中；

⑸重组质粒的鉴定：

挑取若干个大肠杆菌DH5α单菌落做菌液PCR鉴定，阳性菌株进行测序鉴定，pRREP-NTPase-II重组质粒构建完成；

⑹重组质粒的大量提取：

将pRREP-NTPase-II重组菌大量摇菌，按照常规方法提取质粒；

⑺质粒线性化

选用载体RREP上插入基因下游polyA后的BspQI作为线性化的位点，将质粒pRREP-EGFP和pRREP-NTPase-II分别经BspQI酶切过夜，酶切产物去酶纯化后，作为体外转录的模板；

⑻体外转录

使用体外转录试剂盒将pRREP-EGFP和pRREP-NTPase-II分别体外转录成RNA，体外转录产物RNA，经LiCl沉淀纯化，分别得RREP-EGFP、RREP-NTPase-II RNA；

⑼转录产物加帽

使用试剂盒牛痘病毒加帽系统，将体外转录的RREP-EGFP、RREP-NTPase-II RNA进行加帽，加帽产物用LiCl沉淀法纯化回收，即获得可复制型RNA疫苗；

所述步骤⑻中体外转录的具体条件为：

体外转录反应体系如下：ATG 2μl，CTP 2μl，GTP 2μl，UTP 2μl，10×反应缓冲液2μl，线性化DNA模板1μg，RNA聚合酶2μl，RNA酶抑制剂1μl，用去核酸酶双蒸水定量至20μl；

反应条件：混匀，37℃反应12h，取0.5μl转录产物经普通琼脂糖凝胶电泳鉴定，剩余的体外转录产物加入1μl TURBO RNase，37℃孵育15min，去除模板DNA；

所述步骤⑼中加帽的具体条件为：

加帽反应体系如下：RNA 10μg，无RNA酶双蒸水定量至20μl，65℃10min,立即放冰上5min,使RNA变性，去除二级结构；10×加帽反应缓冲液2μl，10mM GTP 1μl，32mM SAM 1μl，RNA酶抑制剂1μl，牛痘加帽酶1μl，温和混匀，37℃温育1h；

所述步骤⑺中BspQI酶为NEB,#R0712S；所述步骤⑻中体外转录试剂盒为MEGAScript^TMKit，Ambion,AM1330M；或者，所述步骤⑼中试剂盒为牛痘病毒加帽系统NEB,#M2080S。