[发明专利]小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用，提供了：分离的多核苷酸，其序列如SEQ ID NO:1、2所示；一种载体，它含有SEQ ID NO:1或2所示的多核苷酸；一种重组载体，含有如SEQ ID NO:7所示的序列；一种小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体及制备方法，是以pEarleyGate 303为骨架载体，在重组位点处置换插入顺序连接的EcoR I、AsiS I、P35S启动子、Not I、SEQ ID NO:1的序列、Sbf I、ACTIN的第四个内含子、BbvC I、SEQ ID NO:1的反向互补序列、Asc I、T35S终止子、EcoR I。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种RNAi表达载体及其构建方法和应用，尤其涉及一种小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

小菜蛾(Plutella xylostella)又名小青虫、两头尖，是白菜、油菜、花椰菜、甘蓝、萝卜等十字花科蔬菜的重要害虫，也是一种在世界上分布广泛的害虫。初龄幼虫仅取食叶肉，留下表皮，在菜叶上形成一个个透明的斑；3～4龄幼虫可将菜叶食成孔洞和缺刻，严重时全叶被吃成网状。由于其发生世代多，繁殖能力强，寄主范围广，抗药性水平高，小菜蛾逐渐取代菜青虫而成为蔬菜第1号害虫，给防治工作带来极大困难。小菜蛾是白菜、油菜、花椰菜和甘蓝等蔬菜的重要害虫之一，目前主要依赖化学农药进行防治。化学农药(甲氨基阿维菌素、氟虫腈、溴虫腈、吡虫啉等)的大量使用，一方面使小菜蛾产生了抗药性，用药量越来越大、抗药性越来越强，形成恶性循环；另一方面蔬菜农药残留直接威胁着人们的生命健康。据统计，我国有200多个癌症村；我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人；同时，胃癌和肠癌在我国也是高发癌症。研究发现，以上癌症的发生主要是由于化学农药残留造成的。

通过基因干涉来防治小菜蛾具有绿色、环保、可持续、经济有效等特点。有利于保护人们生命健康，由于RNAi具有高度的特异性，对非靶标基因或同源性不高的基因没有效果，具有极高的种间特异性。小菜蛾基因干涉防治成败的关键是需要找到有效的靶标基因。关键靶标基因必须具备如下几个特征：1、靶标基因在小菜蛾各个生理小种中高度保守，通过一个基因干涉片段可以对各种不同小菜蛾的生理小种都能起到干涉作用，即水平抗性强；2、靶标基因是小菜蛾生长发育的必须基因，一旦受到干涉，小菜蛾便可立即死亡；3、靶标基因对RNA干涉高度敏感：在小菜蛾体内表达丰度低，低剂量的小RNA即可达到彻底干涉的目的(垂直抗性)。

TOR(Target of Rapamycin)是一种进化中保守的丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，在酵母、动物、植物中通过整合营养和能量信号来促进细胞的增殖和生长。TOR信号通路在动物胚胎形成、分生组织激活，植物根和叶的生长、开花、衰老和生命周期的控制中都扮演着关键作用。近几年研究发现，TOR还具有调节核糖体的生物合成、促进翻译、新陈代谢调节和抑制自噬的功能。在模式动物线虫、果蝇和小鼠中，TOR基因的缺失能够导致动物胚胎致死，说明TOR基因是动物体内的必须基因，在动物的生长发育进程中扮演着核心作用。我们的研究表明，TOR基因是防治小菜蛾的关键靶标基因，TOR蛋白的第一代和第二代抑制剂可以显著抑制小菜蛾幼虫的生长发育。构建TOR基因的RNAi载体来干扰小菜蛾的TOR基因在小菜蛾中还没有被研究过。

发明内容

本发明的目的是提供小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。提供另一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有SEQ ID NO:1或2所示的多核苷酸。