[发明专利]海洋生物源多肽的高效液相色谱和凝胶渗透色谱分离纯化方法

权利要求书

1.海洋生物源多肽的高效液相色谱和凝胶渗透色谱分离纯化方法，其特征是：包括如下步骤：

1）选取单环刺螠内脏，破碎处理后，用丙酮脱脂过夜，离心弃去上清，沉淀在35℃至40℃下干燥后粉碎后得到单环刺螠内脏粉；

2）取步骤1）所述的单环刺螠内脏粉按比例加入蒸馏水，于80℃的恒温水浴锅内加热4h后，离心取上清液，得到的上清液浓缩后为样品，；

3）取步骤2）所述的样品按比例加入蒸馏水，然后调节pH6.8，加入木瓜蛋白酶，在60℃水浴中加热，后用100℃水浴加热10min至15min灭酶，在离心机中4500rpm离心20min后取上清液，将该上清液采用胰蛋白酶水解2-4h，控制提取温度为60℃，pH：10；

4）步骤3）提取完成后调pH至中性后100℃水浴加热10至15min灭酶，以4500~6000rpm离心后取上清液；

5）将步骤4）处理得到的上清液浓缩后，使用95%乙醇沉淀，使乙醇终浓度约为70%~80%，于4℃静置5h至20h，然后将上清液浓缩冷冻干燥得到单环刺螠蛋白酶解产物；

6）生物活性肽的分离纯化：将所述的单环刺螠蛋白酶解产物采用SephadexG-15凝胶色谱柱层析，高效液相色谱分离纯化得到Gln-Pro-Met-Thr-Phe。

2.根据权利要求1所述的海洋生物源多肽的高效液相色谱和凝胶渗透色谱分离纯化方法，其特征是：所述的SephadexG-15凝胶色谱柱层析含有如下步骤：

取所述的单环刺螠蛋白酶解产物，用蒸馏水溶解成100mg/ml溶液，SephadexG-15凝胶色谱柱2.0cm×100cm进行分离纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5ml/min，收集各峰。

3.根据权利要求1所述的海洋生物源多肽的高效液相色谱和凝胶渗透色谱分离纯化方法，其特征是：高效液相色谱的分离纯化具有如下步骤：

用高效液相色谱进一步分离纯化。

4.色谱条件如下：色谱柱采用规格为250mm×4.6mm,5μm的反相C18键合硅胶柱；流动相：A水，B乙腈；收集主要色谱峰，冻干备用得到Gln-Pro-Met-Thr-Phe。

5.根据权利要求1所述的海洋生物源多肽的高效液相色谱和凝胶渗透色谱分离纯化方法，其特征是：步骤2）所述的比例为质量比1：10至1：50或质量体积比50g：500mL至50g：2500mL。

6.根据权利要求1所述的海洋生物源多肽的高效液相色谱和凝胶渗透色谱分离纯化方法，其特征是：步骤3）所述的比例为质量比1：1至1：5或质量体积比50g：50mL至50g：2500mL。

7.根据权利要求1所述的海洋生物源多肽的高效液相色谱和凝胶渗透色谱分离纯化方法，其特征是：步骤3）所述的木瓜蛋白酶占样品溶液质量分数的2%。