[发明专利]具核梭杆菌的恒温检测方法及其专用引物与试剂盒

说明书

本发明公开了具核梭杆菌的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。本发明提供了用于检测具核梭杆菌的环介导等温扩增引物，其由引物1、引物2、引物3、引物4和引物5组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5的核苷酸序列分别为序列表中的序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到具核梭杆菌，不需要复杂仪器，为具核梭杆菌的检测提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测具核梭杆菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及细菌的分子生物学检测方法，特别是涉及具核梭杆菌的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。

背景技术

具核梭杆菌(F.nucleatum)属于革兰阴性专性厌氧菌，参与牙周疾病的炎症反应，常在龈下菌斑中分离到，是在牙周病中起主导作用的微生物，也是成人牙周炎和青少年牙周炎的可疑致病菌之一。该菌除可引起口腔疾病外，还可引起身体其他部位的感染，包括脑、肺和肝，血液和关节，胸和腹部。具核梭杆菌还是一种常见的宫内感染厌氧菌，可在早产且留有完整胎膜的孕妇羊水中检测出，提示其可能在早产发病机制中起了重要的作用。具核梭杆菌作为主要的厌氧微生物在龈下菌斑中聚居，其存在与繁殖引起了牙周组织中局部炎症的发生。

2011年10月，来自加拿大BC癌症研究所和Broad研究所的两个研究小组，证实这种细菌也存在于肠道中，且其在肠道中的丰度与结直肠癌相关。现在，两项新研究提供了功能证据，可帮助解释具核梭杆菌是如何推动癌症形成的。

在发表于2013年8月13日《Cell Host&Microbe》杂志上的两篇论文中，分别由哈佛医学院Aleksandar Kostic和凯斯西储大学Mara Roxana Rubinstein领导的研究小组利用肠肿瘤形成小鼠模型和人类结肠癌细胞，证实具核梭杆菌诱导了促炎症反应和致癌活动，促进了结直肠癌生长。

环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi(Notomi T，Okayama H,MasubuchiH，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic AcidsRes 2000；28(12):63.)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人(Imai M,Ninomiya A,Minekawa H,et al.Rapid diagnosis of H5N1avian influenza virus infection bynewly developed influenza H5hemagglutinin gene-specific loop-mediatedisothermal amplification method.J Virol Methods.2007；141(2):173-80.)利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuyuki Hayashi等人(Hayashi N,Arai R,TadaS,Taguchi H,Ogawa Y.Detection and identification of Brettanomyces/Dekkerasp.yeasts with a loop-mediated isothermal amplification method.FoodMicrobiol.2007；24(7-8):778-85.)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其它与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、虹彩病毒、人类疮疹病毒8型、造血组织坏死病毒(工HHNV)、番茄斑萎病毒和番茄黄化曲叶病毒等。但是迄今为止，市场上还未见用于检测具核梭杆菌的LAMP专用引物与试剂盒问世。

发明内容