[发明专利]一种利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法

权利要求书

1.一种非治疗性和非诊断性地利用囊胚培养液来判断胚胎染色体非整倍体异常的方法，其特征在于，由如下步骤组成：

(1)通过单精子注射方法获得受精卵，将其培养至第3天卵裂球期之后转移至新制备的囊胚培养微滴中以换液并进行囊胚培养，将形成囊胚的胚胎吸出，转移至新的囊胚培养液中或者进入玻璃化冻存流程，剩余的原囊胚培养液即检测时所需要收集的样本，剩余的原囊胚培养液为10微升至200微升，包含来自胚胎的几十皮克的DNA；

(2)将步骤(1)中获取的原囊胚培养液转移至裂解液中，离心；

(3)向步骤(2)中获得的囊胚培养液与裂解液的混合物中加入裂解酶，混匀后孵育，而后使裂解酶失活，取出裂解产物加入包含PCR抑制物对抗剂的PCR反应管中进行全基因组扩增反应；

(4)将全基因组扩增后的DNA产物进行分析，并判断胚胎是否是具有染色体非整倍体异常的胚胎，其中分析时采用二代测序、核酸芯片或者免疫荧光检测；

其中，步骤(3)中进行PCR反应时的PCR反应管中含有扩增混合液、0.5％-20％的PCR抑制物对抗剂、5-20mM dNTP、5-100μM NG和NT引物、50-200μM扩增引物、0.5-10单位核酸聚合酶，所述PCR抑制物对抗剂选自DMSO、甜菜碱、甲酰胺、甘油和白蛋白中的一种或多种，所述核酸聚合酶选自Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Vent聚合酶、Deep Vent聚合酶、KlenowFragment DNA聚合酶I、MMLV反转录酶、AMV反转录酶、HIV反转录酶、超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、E.col i DNA聚合酶、LongAmp Taq DNA聚合酶和OneTaq DNA聚合酶中的一种或多种，

其中所述NG引物从5’到3’为SEQ ID NO：2[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG]的序列，所述NT引物从5’到3’为SEQ ID NO：3[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT]的序列，其中N为任意的可与天然核酸进行碱基配对的核苷酸；所述扩增引物从5’到3’为SEQID NO：6[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG]的序列，

其中，步骤(3)中全基因组扩增的热循环程序如下所述：

(1)在第一变性温度95℃下反应10s；

(2)在第一退火温度10℃下反应45s，在第二退火温度20℃下反应45s，在第三退火温度30℃下反应60s，在第四退火温度40℃下反应45s，在第五退火温度50℃下反应45s；

(3)在第一延伸温度62℃下反应90min；

(4)在第二变性温度95℃下反应20s；

(5)在第六退火温度59℃下反应20s；

(6)在第二延伸温度72℃下反应3min；

(7)重复步骤(4)到(6)10至30个循环；

(8)在72℃下继续延伸反应5min；

(9)将扩增后的产物在4℃下冷藏保存。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剩余的原囊胚培养液为10微升至30微升。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中裂解液的成分是pH为7.0～8.0的Tris-Cl 25-45mM，EDTA 0.5-3mM，KCl 10-25mM以及浓度为0.05％-5％的去污剂，所述去污剂为Triton X-100、Triton X-114、吐温20、NP40和SDS中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，裂解液的成分为pH为7.2的Tris-Cl 40mM，EDTA 1mM，KCl 15mM以及3％的Triton X-100。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的裂解酶选自蛋白酶K、QiagenProtease、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和溶菌酶中的一种或多种，所述裂解酶的浓度为1-25μg/ml。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述裂解酶的浓度为20μg/ml。