[发明专利]一种制备基因DNA探针文库的方法和试剂盒

说明书

本发明提供了一种遗传代谢病的筛查方法和试剂盒。所述方法和试剂盒包括构建如下文库：针对遗传代谢病相关致病基因的每个编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为120bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在60bp的重叠；在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加TAGGTGTGTAGGCGC和GTCAGCTAGTACGCA序列；采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成；用氨水将芯片上的寡核苷酸洗脱下来，溶于水中，形成寡核苷酸混合物；通过PCR的方法，采用5’端带有生物素标记的正向引物(TTAGATAGGTGTGTAGGCGC)和反向引物(TAAGGTGCGTACTAGCTGAC)，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的遗传代谢病相关致病基因DNA探针文库。

技术领域

本发明属于遗传检测，特别涉及基因突变的检测。

背景技术

遗传代谢病是因维持机体正常代谢所必需的某些由多肽和(或)蛋白组成的酶、受体、载体及膜泵生物合成发生遗传缺陷，即编码这类多肽(蛋白)的基因发生突变而导致的疾病。多为单基因遗传病，遗传代谢病一部分病因由基因遗传导致，还有一部分是后天基因突变造成，发病期不仅仅是新生儿，覆盖全年龄阶段。

遗传代谢病对人体损伤极大，常见有神经系统异常、代谢性酸中毒和酮症、严重呕吐、肝脏肿大或肝功能不全、特殊气味、容貌怪异、皮肤和毛发异常、眼部异常、耳聋等，多数遗传代谢病伴有神经系统异常，在新生儿期发病者可表现为急性脑病，造成痴呆、脑瘫、甚至昏迷、死亡等严重并发症。

随着高通量测序技术的发展与成熟，人全基因组测序已经成为遗传代谢病相关致病基因突变研究和诊断的重要工具。通过全基因组测序对被测样本进行全基因组扫描，可实现对基因突变零遗漏，从而成为遗传代谢病相关致病基因突变研究和诊断的有效工具。

由于人类基因组的大小约为3Gb，对其进行全基因组测序总计约需 90Gb测序数据。巨大的数据量要求所致高昂的测序成本，导致全基因组测序应用于遗传代谢病的基因诊断受到限制。

全基因组测序需要产生大量的测序数据量，测序成本高，因此测序深度不可能太深。对于检查基因突变而言，想要实现突变检查的零遗漏，全基因组测序确实难以担当此任。特别是对于，一次检测数百个基因上发生的所有突变，高深度测序才能实现对突变检测的准确性。

因此，开发一款价格低廉的，准确性高的基因突变检查产品，特别是对于遗传代谢病基因突变的诊断产品，具有重要的作用。

发明内容

在第一方面，本发明涉及一种制备基因DNA探针文库的方法：

1)针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为110-130bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3；

2)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加 TAGGTGTGTAGGCGC(SEQ ID NO.1)和GTCAGCTAGTACGCA (SEQ ID NO.2)序列，形成两端带有同样序列的探针序列；

3)合成上述探针序列，形成寡核苷酸混合物；

4)通过PCR的方法，采用5’端均带有标记(例如生物素标记)的正向引物(SEQ IDNO.3：TTAGATAGGTGTGTAGGCGC)和反向引物 (SEQ ID NO.4：TAAGGTGCGTACTAGCTGAC)，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带标记(例如生物素标记)的基因DNA探针文库。

在一个实施方案中，步骤3)中的采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下列，形成寡核苷酸混合物。