[发明专利]一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用

说明书

本发明公开了一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株，该菌株名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LF1，已于2015年09月08日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.11331。本发明还公开了所述重组酿酒酵母菌株在以葡萄糖和木糖为碳源的混合糖培养基或在木质纤维素水解液中发酵生产乙醇的应用。实验证实，本发明的重组酿酒酵母菌株LF1具有较强的葡萄糖木糖共发酵能力，在发酵12小时，葡萄糖完全耗尽，同时有约77.6％(33.24g L^‑1)的木糖同时被利用，预示所述菌株LF1已基本具备利用木质纤维素原料发酵生产燃料乙醇的实际产业化潜力。

技术领域

本发明涉及一株酿酒酵母及其应用，尤其涉及一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

当前，开发利用可再生能源已成为世界各国保障能源安全、加强环境保护、应对气候变化的重要措施。生物燃料乙醇，由于其独特的车用属性，是公认的很有发展前景的可再生生物能源之一。由于以玉米、小麦、木薯、红薯等粮食及非粮淀粉为原料的第1代、1.5代燃料乙醇的生产不可避免地存在“与人争粮”、“与粮争地”的问题，均不能得到大规模发展，因此以储量丰富且廉价的可再生木质纤维素生物质为原料进行第二代燃料乙醇的生产被认为是燃料乙醇可持续发展的必然选择。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是传统的乙醇生产菌株，也是二代燃料乙醇生产的首选发酵微生物。然而，其真正用于二代燃料乙醇的生产需要解决两方面的难题：首先是木糖代谢问题，木糖是木质纤维素原料中含量仅次于葡萄糖的单糖，对其有效的代谢和发酵可以显著降低二代燃料乙醇的生产成本从而提高其经济竞争力，然而，由于缺乏木糖代谢相关基因，天然酿酒酵母并不能很好的代谢木糖；其二是抑制物问题，木质纤维素原料在预处理及酶解过程中，会产生大量对微生物生长及发酵有抑制作用的化合物，故增加酿酒酵母自身对这些抑制物的耐受性可以提高发酵过程中乙醇的生成速率。因此，开发一株能共发酵葡萄糖和木糖同时也具有较高抑制物耐受性的酿酒酵母是目前重点研究的课题，共发酵葡萄糖和木糖的酿酒酵母菌株也是第二代燃料乙醇经济有效生产的必要条件。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用。

本发明所述的共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株，其特征在于：该菌株名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LF1，已于2015年09月08日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)”，保藏编号为CGMCC No.11331。

上述共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株构建的主要技术思路是：将含有异源木糖异构酶基因Ru-xylA表达框的DNA片段整合到酿酒酵母菌株BSIF染色体的PHO13基因座位；进而将含有非氧化磷酸戊糖途径四个基因串联表达框的两个相应DNA片段整合到上述操作获得的菌株染色体的GRE3基因座位的一部分；进而将含有异源木糖异构酶基因Ru-xylA表达框的DNA片段整合到上述操作获得的菌株染色体上的逆转录转座子Ty1上的δ-sequence区域；进而用含有TEF1启动子的DNA序列转化上述操作获得的菌株，将该菌株染色体中XKS1基因的启动子替换为TEF1启动子；进而将上述操作获得的菌株在木糖为唯一碳源培养基中进行长期驯化培养；进而将上述操作获得的菌株在预处理玉米秸秆沥出液中进行长期驯化培养；进而用含有木糖专一性转运蛋白基因Mgt05196(N360F)表达框的DNA片段整合到上述操作获得的菌株GRE3基因座位剩余的另一部分；进而将上述操作获得的菌株在木糖为唯一碳源培养基中进行驯化培养。

具体的，上述共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株的构建方法，步骤是：