[发明专利]口腔致病菌多重PCR检测引物组和探针组及其应用

说明书

本发名公开了口腔致病菌多重PCR检测引物组和探针组及其应用，采用多重PCR同时扩增口腔致病菌中的牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌的特异靶序列，再通过改良Taqman探针熔解曲线分析鉴定，实现对于五种口腔常见致病菌多重检测；采用多重PCR检测操作简单、检测周期短，不会出现假阳性，同时还无需开管操作，可重复使用，节约了资源节省了成本，检测灵敏性特异性高。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种对于五种口腔常见致病菌牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌多重PCR快速检测方法。

背景技术

人体口腔微生物群是一个极其复杂的生态系统，包括病毒，真菌，原生动物和细菌，其中以细菌数量多的，统计表明，每毫升唾液中约有1亿个细菌，整个口腔中的细菌种类超过600种，目前认为牙龈卟啉单胞菌是慢性牙周炎的主要致病菌之一，入血后黏附和侵入动脉血管壁所引起的局部炎症反应，被认为是加速心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)动脉粥样硬化发生发展的重要原因之一；幽门螺旋杆菌作为人体口臭的重要原因，该菌与人体的胃炎、消化性溃疡及胃癌等疾病有密切联系；具核梭杆菌是口腔共生菌，但它有潜力致病，有时会引起牙周病，该菌也可能转移到肠道中，且其在肠道中的丰度与诱发性结直肠癌相关。变形链球菌的过度生长容易引发牙髓炎、尖周炎、牙周炎，其患者也可因菌血症而并发脑栓塞或者细菌性心内膜炎，金黄色葡萄球菌是口腔外感染一种主要致病菌，能够引起包括误吸性肺炎、感染性心内膜炎等口腔外感染疾病。

细菌的分离和培养是针对上述五种口腔致病菌最为传统的检测及鉴定方法，这种方法存在明显的缺陷，不仅培养条件和操作复杂，检测周期长，且特异性敏感性都受到很大的限制；随着分子诊断技术的发展，为人们提供多种特异、灵敏和快速的微生物检测方法，例如基于蛋白质水平发展起来酶联免疫吸附剂测定法(enzyme linkedimmunosorbentassay，ELISA)和蛋白质印迹法(Western Blot，WB)，针对特定微生物制备特异抗体，从而实现对微生物的高效灵敏检测，该方法较传统方法有一定的提高，但是存在较高的假阳性率风险，临床效果不佳；随着近年来PCR诊断技术的进步和成熟，PCR应用于微生物定性和定量检测领域越来越受到临床研究的重视，在传统PCR系统中，针对特异靶序列设计的寡核苷酸引物进而扩增特异产物并且结合应用于凝胶鉴定、测序分析，或者与限制性酶切技术或者RAPD技术结合可以对特定微生物进行准确、灵敏的鉴定分析，但该类型PCR不仅操作复杂，而且需要对PCR产物进行开管操作，容易引发污染，造成假阳性现象，而且这些类型PCR仅限于单次反应鉴定单个特异靶序列，并且如果需要实现多种口腔致病菌的检测则需要浪费大量的试剂和时间。

发明内容

为解决上述现有技术操作复杂、检测周期长、特异性灵敏性受限、假阳性出现率高、需开管操作、易引发污染、检测效率低、成本高等问题，本发明采用如下技术方案：

一种口腔致病菌多重PCR检测引物组和探针组，包括引物混合物和探针混合物，所述引物混合物成分如下：

牙龈卟啉单胞菌的上游引物为5’-gtcgtttacgagcagccttc-3’

牙龈卟啉单胞菌的下游引物为5’-tttggcttccgttctattgg-3’

幽门螺旋杆菌的上游引物为5’-ggaaaccgattgccttcata-3’

幽门螺旋杆菌的下游引物为5’-tgatgaacagcaccagaagc-3’

具核梭杆菌的上游引物为5’-ccagctggcattcccttt-3’

具核梭杆菌的下游引物为5’-ttttatcggttggaggcaag-3’

变形链球菌的上游引物为5’-ctaaggattccaggggaagg-3’