[发明专利]一种病毒灭活去除纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁复溶性的药物组合物

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种低温乙醇沉淀、低PH法结合切向流超滤制备收率高、效价稳定、低病毒的乌司他丁的制备方法及提高乌司他丁复溶性的药物组合物。

背景技术

乌司他丁（ULinastatin）系从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化出来的一种酸性糖蛋白，是一种广谱的蛋白酶抑制剂，主要在肝脏中合成，由肾脏代谢随尿液排出，且其分解形成的低分子量成分也具有很强的抑制水解酶的作用。乌司他丁由143个氨基酸组成，相对分子质量约37000~43000，属于蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶及粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、巯基酶、纤溶酶等多种酶有抑制作用，还具有稳定溶酶体膜、抑制溶酶体酶的释放、抑制心肌抑制因子（MDF）产生、清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用。乌司他丁还可改善手术刺激引起的免疫功能下降、蛋白代谢异常和肾功能降低，防止手术刺激引起的对内脏器官与细胞的损伤以及改善休克时的循环状态等。

1909年欧洲首先报道人体尿液存在着胰蛋白酶抑制剂，随后人们发现，当人体受到感染、发热、肿瘤、妊娠、休克、手术、给予糖皮质激素等刺激时，人体尿液中UTI活性升高。1985年由日本首先开发上市，在日本已作为急性胰腺炎、急性循环衰竭的治疗药物被广泛应用于临床。

本发明人自2008年开始对UTI的生产工艺进行试验研究，采用现代蛋白质高端生化分离技术进行生产，使UTI的总收率提高到70%以上，总效价不低于5000iu/mg，柱效提高约50%。近期我们组织相关人员进行科研攻关，最终采用低温乙醇沉淀、低PH法结合切向流超滤来纯化乌司他丁，病毒去除率不低于4log，生产工艺稳定，质量可控。

发明内容

本发明提供了一种病毒灭活去除纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁复溶性的药物组合物，是为了攻克高岭土吸附、耐酸性混合模式吸附等传统方法提取乌司他丁收率过低、效价不高不稳定、病毒指标不明的缺点，采用低温乙醇沉淀、低PH法结合切向流超滤来纯化乌司他丁，从而提高了乌司他丁的收率，保证了效价的稳定及用药安全性。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种病毒灭活去除纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁复溶性的药物组合物，其特征在于：选用采用低温乙醇沉淀、低PH法结合切向流超滤来纯化乌司他丁，可以使总收率提高到70%以上，总效价不低于5000iu/mg，柱效提高约50%，病毒去除率不低于4log。

该技术方案中，其技术特征还在于所述方法包括如下步骤：

1）乌司他丁粗加工

称取1TpH小于6.5的澄清尿液，不断搅拌，缓慢加入16.5kg甲壳质吸附完全后用氨水洗脱，再经过3.5kg硫酸铵盐析，过夜沉淀、离心后置于用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得乌司他丁粗品。

2）吸附柱层析（以0.25LDEAE树脂柱为例）

2.1）将柱中的DEAE树脂用纯化水反冲下来，装入桶中，用纯化水浸没搅匀，静置，反复多次，纯化水浸没过夜；

2.2）将DEAE树脂滤干，用少量纯化水洗涤，再次滤干后装入桶中，用0.5mol/L盐酸浸没，搅拌，过滤，用纯化水洗至中性，再用0.5mol/LNaOH溶液浸泡，搅拌，过滤，再用纯化水洗至中性；

2.3）将上述经处理过的DEAE树脂加洗脱液A反复平衡到pH6.5后，再用洗脱液A浸泡待用；

2.4）将上述平衡好的树脂装入柱内，柱装好后，再用洗脱液A走柱；

2.5）称取乌司他丁粗品1kg，用洗脱液A溶解，搅拌30分钟，离心20分钟，留取离心液，在60℃水浴搅拌加热10小时；

2.6）将上述离心液流经平衡好的DEAE树脂柱，流速控制在120~130mL/min左右；

2.7）用洗脱液B溶液洗脱，流速控制在120~130mL/min，得洗脱液；

2.8）将洗脱液经超滤膜，超滤至其体积的二十分之一，得超滤液约1.65L。

3）亲和层析（以0.25L柱体为例）

3.1）用洗脱液C平衡亲和层析柱，将超滤液流经平衡过的树脂柱，流速控制在120~130mL/min；

3.2）上样结束后，用洗脱液C洗脱，流速120~130mL/min左右，收集洗脱液；

3.3）柱中的亲和树脂经洗脱液C洗脱后，用洗脱液D洗涤去除吸附在上面的杂质，流速控制在120~130mL/min，密封待用；