[发明专利]一种小鼠组织中结核杆菌DNA的提取方法在审
| 申请号： | 201510749531.5 | 申请日： | 2015-11-06 |
| 公开（公告）号： | CN105219764A | 公开（公告）日： | 2016-01-06 |
| 发明（设计）人： | 柳爱华;宝福凯;杨佳儒;徐翠平;韩欣霖;麻明彪;彭芸;陶律延 | 申请（专利权）人： | 昆明医科大学 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10;C12R1/32 |
| 代理公司： | 昆明今威专利商标代理有限公司 53115 | 代理人： | 赛晓刚 |
| 地址： | 650500 云南省昆明*** | 国省代码： | 云南;53 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 小鼠 组织 结核杆菌 dna 提取 方法 | ||
1.一种小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)将小鼠肺组织匀浆离心后弃上清，加入GA缓冲液和蛋白酶K溶液后，50～56℃水浴3～12h，进行组织溶解得到细胞悬液；
步骤(2)细胞悬液中加入pH为8的TES缓冲液和5％的SDS溶液后，先置于温水浴中40min，再置于沸水浴60min，最后在冰上放置5min，得到混悬液；
步骤(3)在混悬液中加入pH4.8的醋酸钠溶液和0.05mol/L的葡萄糖溶液，冰上放置10～20min；然后加入苯酚/氯仿/异戊醇溶液提取，离心后取上层水相，上层水相中加入氯仿/异戊醇提取，离心后，取上层水相，加入乙醇，充分震荡后，－20℃沉淀30min，离心得到沉淀物，沉淀物即为总DNA，总DNA进行PCR扩增得到小鼠肺组织中结核杆菌DNA的载量。
2.如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述GA缓冲液、蛋白酶K溶液来源于细菌基因组DNA提取试剂盒，蛋白酶K溶液的浓度为2mg/ml。
3.如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，pH为8的TES缓冲液中含有溶菌酶，溶菌酶的浓度为20mg/mL。
4.如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，步骤(2)所述温水浴的温度为36～37℃。
5.如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述苯酚/氯仿/异戊醇溶液中苯酚、氯仿和异戊醇体积比为25：24：1，所述氯仿/异戊醇溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
6.如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，所述离心的转速为12000r/min,离心时间为10min。
7.如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，所述QPCR扩增采用的引物序列为：
前引物：5’－AGAAGGCGTACTCGACCTGA－3’
后引物：5’－CTGAACCGGATCGATGTGTA－3’。
8.如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，QPCR扩增条件为：94℃预变性3s，94℃变性1min，52℃退火30s，72℃末次延伸30s，变性与退火循环35次。
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