[发明专利]一种禽流感全病毒颗粒标记疫苗的制备方法及其产品和用途

说明书

本发明公开了一种禽流感标记疫苗的制备方法及其产品和用途。所述方法包括：a)病毒培养；b)膜深层过滤、微滤、超滤；c)甲醛灭活；d)亲和层析以及在柱核酸酶解；e)疏水反应层析纯化；f)透析，除菌过滤；g)乳化。本发明提供的禽流感标记疫苗抗原为均一完整的禽流感病毒颗粒，不含禽流感病毒的非结构蛋白，不含未成熟的其他大小、形状的病毒颗粒。注入动物体内只产生针对禽流感病毒表面抗原的抗体，血凝素抗体和神经氨酸酶抗体，因此，能够完全区别动物感染和免疫禽流感病毒，有效降低了疫苗注射引起动物潜在过敏反应风险，降低了动物传染病如新城疫、禽流感等传播的潜在风险，安全性高，对动物食品安全和贸易没有影响。

技术领域

本发明涉及一种禽流感标记疫苗的制备方法及其产品和用途，特别涉及一种通过MDCK细胞悬浮培养禽流感病毒、以及采用新的浓缩纯化方法制备禽流感标记疫苗的方法，还涉及标记疫苗的质量标准和检定。本发明属于医药生物技术领域。

背景技术

疫苗接种是特异性预防禽流感病毒(AIV)的有效手段，制备安全有效的疫苗是成功地预防、控制乃至最终消灭AIV的先决条件。疫苗使用的效果取决于快速大量疫苗的生产和供给，最近几年的流感流行和新的流感病毒爆发流行提示及时的疫苗接种是控制、预防流感的最重要措施。但是各地流行的高致病性禽流感亚型不同，疫苗株和流行株的抗原性不匹配或匹配程度低，给疫苗的开发和研制带来的极大挑战。目前国内鸡胚禽流感疫苗存在的问题，主要为：

1)疫苗诱导抗体妨碍识别感染和免疫禽类；

2)疫苗预防禽流感发病而不能预防阴性感染；

3)免疫产生的压力促使禽流感病毒抗原突变逃逸免疫；

4)免疫保护产生的时间晚，免疫保护期短；

5)母婴抗体对新生禽类免疫的干扰；

6)疫苗对各种禽类的免疫效果不是很清楚；

7)疫苗的质量：安全性、免疫原性、有效性、稳定性有待提高。

用鸡胚生产禽流感疫苗，鸡胚供应和生产周期长，难以应对新发禽流感的防控；传统的兽用流感疫苗由于采用鸡胚规模化生产，疫苗尽管安全但容易引起严重的应急反应，需要对工艺进行改造、验证。

禽流感病毒灭活疫苗具有良好的免疫原性，在预防和控制禽流感的过程中发挥着重要作用，但在疫苗制备过程中和产品中的一些宿主细胞蛋白残余、核酸、牛血清白蛋白、化学试剂等如果不加以控制，则会引起免疫动物产生严重副反应甚至死亡，特别是可能使动物致癌或影响肉类动物的食品安全。

用宿主细胞MDCK培养病毒制备疫苗抗原或重组药物，从用药安全性考虑，必须纯化抗原去除影响禽流感病毒疫苗安全性的杂质，以使其符合药品质量规范和安全要求，同时尽量减少工艺或原辅材料中可能潜在的影响疫苗效果和安全的物质，特别是要尽量避免使用动物源性的原辅材料，以降低传播动物疫病如流感、犬瘟热、疯牛病、狂犬病等传染病风险。

用生物反应器生产禽流感病毒抗原，提高了细胞密度、病毒抗原产量，同时增加了细胞杂质和添加物的量，也增加分离、浓缩、纯化禽流感病毒的工艺步骤。过去因为禽流感病毒疫苗抗原库主要以鸡胚作为抗原生产基质，疫苗多为粗制疫苗。纯化技术特别是现代规模化浓缩、纯化病毒抗原技术，如柱层析、蔗糖梯度超速离心技术、切向流中空纤维柱、深层过滤模块几乎没有在兽用疫苗生产中使用。这些技术和设备的应用易于疫苗质量控制和保证，也易于GMP认证和工艺验证。

现行生产灭活禽流感病毒抗原采用MDCK细胞为疫苗抗原生产基质，MDCK细胞悬浮培养后继灭活、浓缩工艺达到部分纯化，后经乳化制成疫苗供使用。尽管该疫苗的免疫效果达到疫苗规程要求，但按现代疫苗的安全性要求，杂质含量高、总蛋白含量高，有效完整病毒颗粒含量低，对有效抗原量、MDCK细胞DNA残余、MDCK细胞蛋白残余、牛血清白蛋白、灭活剂、防腐剂以及生产过程化学添加物没有明确界定和定量。疫苗的质量标准和工艺应不断提高，以保证疫苗稳定、安全、有效。