[发明专利]类产碱假单胞菌株及其在制备西他列汀中间体中的应用

说明书

本发明公开了一种类产碱假单胞菌株及其在制备西他列汀中间体中的应用，类产碱假单胞菌XW‑40菌落表面形态扁平，圆形，边缘光滑整齐，呈潮湿状，颜色呈乳白色，不透明，菌落直径约为1.9mm。该菌株能够有效催化4‑氧‑4‑[3‑(三氟甲基)‑5,6‑二氢[1,2,4]三唑并[4,3‑a]‑吡嗪‑7(8H)‑基]‑1‑(2,4,5)‑三氟苯基)丁‑2‑酮还原为西他列汀手性中间体，在最适反应条件下能耐受10g/L的高底物浓度，且仍保持高选择性，底物抑制作用较弱，可实现高底物浓度的生物催化。该菌体还能够循环使用，与分批补料相比，同时去除了底物与产物对细胞的抑制作用，使菌体的催化活性达到最大限度的利用。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种类产碱假单胞菌株及其在制备西他列汀中间体中的应用。

背景技术

磷酸西他列汀(sitagliptin phosphate)是默沙东公司第一个研制的用于治疗2型糖尿病的二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，该药能有效地针对2型糖尿病中的胰岛素抵抗和胰岛α、β细胞的功能障碍，通过抑制DPP-4减缓肠促胰岛素GLP-1的降解，从而发挥降糖作用。与易导致低血糖、体重增加和引起恶心呕吐等副作用的传统口服降糖药物相比，该抑制剂具有明显的优势和良好的市场前景。磷酸西他列汀关键的手性中间体主要有两个，一个是手性β-氨基酸，一个是其相应的手性醇中间体，目前关于西他列汀的合成工作重点主要围绕这两个手性中间体展开。

目前文献报道此手性β-氨基酸的合成方法主要有以下几种：

(一)采用手性源诱导出手性的α-氨基酸，而后经重氮化反应产生β-氨基酸，从而构建手性中心，该路线所用原料较为昂贵，反应条件相当苛刻，如需要-78℃及-30℃等低温条件，且有些反应所需时间较长且操作较为繁琐，中间产物的精制需要经过柱层析分离；

(二)采用手性磷钌催化剂对酮酯进行不对称催化氢化，构建手性二级醇，然后将手性二级醇手性反转为二级胺，该路线中手性催化剂价格昂贵，放大效应明显；

(三)β-烯氨基酸中间体的不对称氢化，不对称氢化反应在昂贵的金属催化剂如与手性膦/二膦配体相组合的铑的存在下进行或是使用昂贵的钌金属催化剂；

(四)以异丙胺为氨供体，以西他列汀前体酮为氨受体，利用转氨酶生物催化制备西他列汀，该方法具有环境友好，反应条件温和等优势，但特殊酶的不易获得和价格的高昂特性(分离方案等)不可忽视；

(五)以三氟苯甲醛和N-乙酰甘氨酸经缩合、还原、生物酶拆分、水解、保护氨基、重氮化、Arndt-Fistert重排反应、水解得R-β-氨基丁酸，但是所述合成路线过长，手性拆分获得手性氨基酸的收率不超过50％，另外一半对映异构体的循环利用是一大难题，且反应过程用到重氮甲烷，重氮甲烷室温下是不稳定的有毒气体，具有爆炸性，操作危险。

而目前文献报道相应的手性醇中间体的合成方法主要如下：

(一)WO 09/045507利用适当的羰基还原酶对β-羰基部分进行不对称还原得到β-羟基中间体，再与氮杂环丁酮中间体反应得到西他列汀，该方法的缺点在于：在高压下反应、使用非常昂贵的金属手性催化剂(Rh或Ru)、低立体选择性和铑污染产物以及由此引起的最终化合物很难纯化；

(二)WO12/046254公开制备通过酶促转化制备西他列汀的中间体的方法，提供了两种生物催化合成手性醇中间体的方法，分别为利用工程菌全细胞和工程菌所产的羰基还原酶的粗提物作为生物催化剂，将西他列汀前体酮还原为相应的(S)构型的醇；其方法具有环境友好，反应条件温和，ee值高等优势，但在另一方面，工程菌的构建有很大的难度而且花费昂贵，使用粗提酶作为生物催化剂存在的问题是游离的粗酶在反应液中不稳定，酶的催化能力较低，酶容易失活，不易实现酶的循环使用，且后期的分离操作复杂；而使用整细胞作为催化剂，将底物溶于甲苯中进行两相催化反应所存在的问题是，底物在甲苯中溶解度小，反应所转化的底物浓度较低，不适合大规模工业化生产。