[发明专利]一种高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及天然产物提取分离技术领域，尤其涉及一种高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法。

背景技术

灵芝是一种珍贵的药用真菌，具有滋补强身、扶正固本的功效，黑灵芝是灵芝属中的一个重要品种。大量研究表明多糖是灵芝的主要功能成分之一，黑灵芝多糖已被证实具有良好的免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、保护心脏和抗糖尿病等生物活性，因此，在医药保健品等领域被认为具有广阔的开发前景。

多糖的分离纯化方法有多种，其中，氧化法和阴离子交换色谱法常用于多糖的脱色和初步分离；而精细分离常用的方法是凝胶柱层析法，该法按分子质量大小对多糖成分进行分级，可以得到分子质量分布较窄的多糖级分。灵芝多糖提取物成分复杂，除活性多糖外，还含有蛋白质和多酚类等杂质，给灵芝活性多糖的分离纯化带来很大麻烦。目前，灵芝多糖的分离纯化通常结合两到三种方法，这样可以得到纯度高、分布窄的多糖级分。如方积年“一种灵芝多糖及制备方法和应用”(专利号：CN1537867A)，该专利采用梯度洗脱阴离子交换色谱与凝胶柱层析联用法，获得了高纯度的活性多糖组分，该方法已广泛应用于赤灵芝多糖的分离纯化。

Q-SepharoseFastFlow是一种强阴离子交换树脂，根据分离物质所带电荷的多少来进行分级，能在较宽pH范围内对生物大分子进行有效分离；该树脂具有高通量、快速高效等特点，在多糖纯化领域主要应用于中性多糖和酸性多糖的分离，可实现大规模的制备。常见的梯度洗脱阴离子交换色谱可以在较短时间内对多糖进行初步分离，但很难制备性质均一的多糖组分；而凝胶柱层析法由于耗时长、稳定性差等问题，制约了灵芝多糖的分离效率，无法大量制备具有生物活性的多糖组分。本发明采用Q-SepharoseFastFlow作为分离介质，通过不同浓度盐溶液作为洗脱液进行分段洗脱，试图提供一种高效分离制备黑灵芝免疫活性多糖的方法，该方法可提高多糖纯度和富集免疫活性多糖组分的作用，操作简单、重现性好、效率高，克服了凝胶柱等分离技术效率低、耗时长、分离不彻底等的不足。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明由黑灵芝精制多糖制备免疫活性多糖的方法的具体步骤如下：

(1)粗多糖制备：黑灵芝子实体粉末经95％的食用乙醇浸泡24h后，过滤、干燥，将滤渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：40的比例混合，于90℃下搅拌浸提2h。提取液经过滤除杂后，真空浓缩至原体积的1/5，缓慢向浓缩液中加入无水乙醇，并不断搅拌，至乙醇终浓度为80％，置于4℃冰箱中醇沉过夜，离心，得到沉淀物，冷冻干燥即得黑灵芝粗多糖。

(2)精制多糖制备：将步骤(1)制备的粗多糖溶于蒸馏水中，配成浓度为20mg/mL的溶液，将Sevage试剂(氯仿与正丁醇按照体积为4：1的比例混合)按多糖溶液的1/3体积加入，混合、剧烈振摇搅拌后，以4500rpm的转速离心10min，除去蛋白层，多糖溶液继续用Sevage试剂处理，如此重复3～5次至无游离蛋白析出为止；多糖层经透析、浓缩后，采用80％乙醇醇沉，沉淀经无水乙醇、丙酮和乙醚分别洗涤后，冷冻干燥得精制多糖PSG。

(3)多糖的分离纯化：将步骤(2)中的精制多糖PSG溶于蒸馏水中，配成3～5mg/mL的溶液，离心(5000rpm的转速离心10min)，除去不溶物；将20～30mL多糖溶液加入阴离子交换柱(色谱柱规格为1.5x10cm)中，使样品与树脂充分交换10min；第一阶段用纯水洗脱未被吸附的样品，吸附在树脂上的样品再依次用5倍柱体积的0.1,0.2,0.5和2M的NaCl溶液分段洗脱，流速均控制在10mL/min左右，分别收集不同组分，对水透析脱盐、浓缩、冷冻干燥，得5个不同级分(图1)，分别记为Fw,F_0.1,F_0.2,F_0.5和F₂。