[发明专利]对虾偷死野田村病毒荧光定量RT-PCR检测方法

权利要求书

1.一种对虾偷死野田村病毒荧光定量RT-PCR检测方法，包括如下步骤：

1)将样品保存在饱和醋酸铵溶液中，采用RNA提取试剂盒制备RNA。

2)采用一步法荧光定量RT-PCR试剂盒配制反应液，其中反应体系总体积为25μL：反应缓冲液12.5μL，TaqHS混液为1μL，PrimeScriptPLUSRTase混液为1μL，ROX参比染料为1ul和无RNase水为6.0μL，10mmol/Lde探针0.5μL，同时加入所述的两个引物和RNA，引物的终浓度为1μL，待检RNA为1μL。

3)将上述反应液在实时荧光定量PCR系统上进行RT-PCR反应，条件如下：逆转录反应：42℃，10分钟；95℃，10秒；PCR反应：95℃，5秒；60℃，30秒；40个循环。如果出现扩增曲线、Ct值小于35个循环且Tm值为81.53±0.14℃范围内可判断结果为阳性，否则即为阴性。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤2)中，引物和探针的序列如下：

引物1：5'-CCGACAAGGTATCCAAAGC-3'

引物2：5'-ACCTGTTAGGTACGCTACCACT-3'

探针：5'-CGCTCACGGCTTTGGATACCTT-3'。

3.如权利要求1所述的方法，其中步骤2)中，探针浓度为0.2μL(10mmol/L)。

4.如权利要求1所述的方法，其中步骤3)中，其中实时荧光定量PCR系统可以为罗氏LightCycler480II荧光定量PCR系统、罗氏LightCycler96荧光定量系统或AppliedBiosystems7500R荧光定量系统。