[发明专利]一株表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株及构建方法

权利要求书

1.酿酒酵母菌株的构建方法，包括以下步骤：

1）构建出发菌株：将酿酒酵母SEB3进行产孢子后，筛选出单倍体菌株SEB3α25，利用同源重组的方法将单倍体菌株SEB3α25中的URA3-XYL1-XYL2片段进行敲除，再以KanMX为筛选标记，将单倍体菌株SEB3α25的GRE3基因进行敲除，得到出发菌株YC-8，所述酿酒酵母SEB3的保藏号为CGMCC11323；

2）构建表达载体：获得如SEQ ID NO：1所示的PXYLA2基因，然后通过酶切、连接的方法将PXYLA2基因连接在酵母多拷贝质粒pRS426中，构建出多拷贝表达载体pRS426-PXYLA2；

3）将多拷贝表达载体pRS426-PXYLA2导入酵母菌株YC-8中，构建出工业酿酒酵母YCPA2；

4）利用两段式进化工程对菌株YCPA2进行驯化后获得菌株SEB7；所述两段式进化工程包括：有氧生长驯化和微氧发酵驯化；

所述有氧生长驯化过程如下：按起始OD660=0.05的接种量，将菌株YCPA2接入含100 mL2%的YNBX培养基中，30℃下180 rpm转速摇床培养到细胞生长对数期，再按OD660=0.05接种量转接入新的培养基，如此反复培养转接，总共驯化28天；

所述微氧发酵驯化过程如下：有氧生长驯化结束后，将菌株按起始OD660=0.05的接种量，接入含100 mL 2%的YNBX培养基中，于水浴锅中30℃下200 rpm的转速培养，待菌株生长到对数期时，将菌株按起始 OD660=0.05转接入新的培养基，如此反复培养转接，驯化24天后得到SEB7菌株；

所述2%YNBX培养基主要由1.7 g/L无氨基酵母氮源、10 g/L 硫酸铵、20 g/L木糖构成。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述PXYLA2基因的获得过程如下：

将源自于普雷沃氏菌TC2-24的木糖异构酶基因PXYLA1，通过密码子优化后获得适合在酿酒酵母中进行表达的PXYLA2基因。

3.根据权利要求1所述的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述多拷贝表达载体pRS426-PXYLA2通过醋酸锂法导入酵母菌株YC-8中。