[发明专利]南美白对虾中副溶血性弧菌分子预测模型的构建方法

权利要求书

1.一种南美白对虾中副溶血性弧菌的分子预测模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

生鲜南美白对虾的采样和贮藏；

生鲜南美白对虾的处理；

生鲜南美白对虾中副溶血性弧菌的活菌定量测定；

根据副溶血性弧菌的活菌定量测定值构建一级模型和二级模型；

对所述一级模型和二级模型进行验证。

2.如权利要求1所述的南美白对虾中副溶血性弧菌的分子预测模型的构建方法，其特征在于，所述生鲜南美白对虾的采收和贮藏的方法为：

在每年8月份对虾塘中南美白对虾进行一次采样，共取540只南美白对虾样品，分为6组，分别置于4℃、7℃、15℃、20℃、25℃、30℃下贮藏，另取18个样品留作副溶血性弧菌最初污染量的定量分析备用。

3.如权利要求2所述的南美白对虾中副溶血性弧菌的分子预测模型的构建方法，其特征在于，南美白对虾样品从采样到贮藏的时间不超过1h。

4.如权利要求1所述的南美白对虾中副溶血性弧菌的分子预测微生物模型的构建方法，其特征在于，所述生鲜南美白对虾的处理方法包括如下操作：

对不同贮藏温度的南美白对虾进行取样：4℃条件下贮藏360h，每24h取6只南美白对虾；7℃条件下贮藏180h，每12h取6只南美白对虾；15℃条件下贮藏75h，每5h取6只南美白对虾；20℃条件下贮藏60h，每5h取6只南美白对虾；25℃条件下贮藏42h，每3h取6只南美白对虾；30℃条件下贮藏24h，每2h取6只南美白对虾；

分别将南美白对虾样品置于含有蛋白胨水溶液的均质袋中均质2min后，收集南美白对虾液均浆，用于后续的副溶血性弧菌活菌定量分析。

5.如权利要求1所述的南美白对虾中副溶血性弧菌的分子预测模型的构建方法，其特征在于，所述副溶血性弧菌的活菌定量测定的方法包括如下操作：

S1、PMA母液的制备：每980μLddH₂O中溶解入1mgPMA，得到的2mM的PMA母液，于-20℃下避光保存；

S2、PMA前处理：每975μL南美白对虾液均浆加入25μL的PMA母液，获得25μMPMA终浓度的PMA-样品混合液；将所述PMA-样品混合液置于黑暗条件下处理15min后，利用光解仪处理后，进行离心，收集菌体；

S3、DNA提取：参照天根细菌基因组DNA提取方法对所述菌体中的DNA进行提取，菌体的收集时间为10min、溶菌酶的处理时间为1h、蛋白酶K的处理时间为2h；

S4、PMA实时荧光PCR活菌定量测定：

选择副溶血性弧菌的tlh基因作为PMA实时荧光PCR扩增的靶基因，以对应的TaqMan探针标记FAM作为报告基团，BHQ1作为淬灭基团，所述扩增所用的引物的序列为，正向引物：5’-ACTCAACACAAGAAGAGATCGACAA-3；反向引物：5’-GATGAGCGGTTGATGTCCAA-3’，TaqMan探针的序列为：5’-FAM-CGCTCGCGTTCACGAAACCGT-BHQ1-3’；

制备PMA实时荧光PCR反应体系，其中，每20μL反应体系中各组分分别为：10×PCRBuffer2μL、浓度为50mM的MgSO₄溶液1.2μL、浓度为10mM的dNTPsmix溶液0.5μL、浓度为5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL、稀释至终浓度为10μM的三对引物各0.5μL、稀释至终浓度为10μM的三根探针各0.2μL、DNA模板1μL以及ddH₂O12.5μL；

进行40个循环的PMA实时荧光PCR反应，在每个所述循环中，控制95℃预变性2min，95℃变性时间为15s，退火温度为60℃，退火时间为1min；

将PMA实时荧光PCR反应输出的CT值与所述南美白对虾的副溶血性弧菌浓度与CT值关系的标准曲线进行对照，获得对应的南美白对虾中的副溶血性弧菌浓度。