[发明专利]杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系及其应用

说明书

本发明公开了杏鲍菇复合群EST‑SSR分子标记特异引物体系，它是采用5对分子标记特异引物，在检测过程中同时使用，在30个杏鲍菇复合群菌种中有多态性，在30个杏鲍菇复合群中进行的遗传多样性分析与侧耳属白灵菇、杏鲍菇和阿魏菇的分类常识相吻合，是稳定存在的新标记，可以直接将本发明所提供的5对引物对应用于更多杏鲍菇复合群上，进行种质资源和遗传多样性分析，5对分子标记特异引物均来自于杏鲍菇复合群发育相关基因EST序列，为克隆杏鲍菇复合群发育相关基因、基因序列分析奠定了良好的基础，并且大大缩短了分析周期，提高研究效率，对食用菌分子标记选择育种的发展具有重要意义。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系及其在鉴别杏鲍菇复合群的不同菌株的用途。

技术背景

杏鲍菇（Pleurotus eryngii），又名刺芹侧耳，因其具有杏仁的香味和菌肉肥厚如鲍鱼的口感而得名。是近年来开发栽培成功的及食用、药用、食疗于一体的珍稀食用菌新品种。阿魏菇（Pleurotus ferulae）又名阿魏侧耳、阿魏蘑，属担子菌亚门层菌纲伞菌目侧耳科侧耳属，是干旱草原上具有代表性的蕈菌。由于其子实体脆嫩可口，香味浓郁，有草原牛肝菌的美称；又因其具有消积、杀虫、治疗肉积、痞块、久疟、疳劳等药效，当地群众誉之为天山神菇和西天白灵芝。白灵菇(Pleurotus eryngii subsp. tuoliensis) 是白灵侧耳的商品名称，隶属于真菌门、担子菌亚门、真菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，是近年来逐渐发展起来的食用菌新秀之一。

杏鲍菇、白灵菇、阿魏菇形态相似，且遗传关系尚不明确。有研究人员认为，阿魏蘑与白灵菇为刺芹侧耳种下的2个变种，但也有人认为，这三者分别为不同的种。白灵菇与阿魏蘑在外观和口感上均很接近，人们易将两者混淆。但实际上它们是亲缘关系非常近的两个种。利用PCR 产物克隆测序测定了阿魏菇、白灵菇与杏鲍菇rDNA 内转录间隔区( ITS)的序列，测序比对结果表明，阿魏蘑、白灵菇和杏鲍菇三者之间亲缘关系较近，其中白灵菇与杏鲍菇具有非常近的亲缘关系,但阿魏蘑、白灵菇和杏鲍菇为3个不同的种。因此，本发明中暂称三个菌种为杏鲍菇复合群。

食用菌最早是采用形态学特征为分类依据，虽然形态特征能在一定程度上进行很好的类群的划分，但子实体的形态特征易受外界环境条件的影响，因而很不稳定。因此，形态鉴别不能准确反映被鉴定物种的分类地位。除了形态学分类外，还有利用拮抗试验、同工酶分析来进行菌株的鉴定，但是他们都各自有一些缺点，受影响的因素很多，还需要辅助其他试验才能将菌株鉴别清楚。

近年来，随着分子生物学和生物技术的迅速发展，遗传标记技术也得到了迅猛的发展。目前，用于作物种质资源鉴定的分子标记主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，但对于核心种质构建、基因性状鉴定、品种指纹图谱建库等研究，SSR分子标记是公认的最佳方法。开发SSR标记主要有构建与筛选基因组文库法、微卫星富集法、省略筛库法和数据库搜索法等。其中数据库搜索法,尤其是从表达序列标签(EST)数据库中搜索，开发EST-SSR标记，已经成为一种广为采用的方法。EST-SSR标记相对于基因组SSR标记而言，由于其来自于转录谱，能够反映出转录区的差异，使EST-SSR标记可以直接与目标性状(如高产或多抗)相联系，在分子标记辅助选择上具有更高的应用价值。

针对食用菌的SSR分子标记引物系统比较少，目前国内外还没有针对杏鲍菇复合群鉴定的专用EST-SSR分子标记特异引物，因此本发明对于杏鲍菇、白灵菇、阿魏菇及其复合群的资源鉴定和开发利用具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系及其应用。

杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系，它包括：引物1、2、3、4和\或5；

引物1：AAGAGACCGCAAACGAAATG