[发明专利]快速定量测定白酒发酵过程微生物群落组成的方法

说明书

本发明涉及一种快速测定白酒发酵过程中微生物群落组成的方法，其特征是通过在PCR反应体系中使用门特异性引物达到白酒发酵过程中对具体某个门的微生物菌群的特异扩增，并使用qPCR体系进行定量扩增，获得定量识别。本发明根据已知微生物门类，分别设计了拟杆菌门，变形菌门，厚壁菌门，互养菌门和放线菌门的引物，基于门特异性引物的定量扩增可以在门的层面上快速考察白酒发酵过程中微生物群落的宏观结构变化。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的微生物群落操作方法，是基于门特异性引物(phylum-specific primer，PSP)，测定白酒发酵过程中微生物群落组成结构的快速PSP-qPCR定量方法。

背景技术

天然复杂微生物群落一般由几十、几百甚至更多不同种微生物组成，而且该组成在不同的环境条件下会发生动态变化。几乎所有的天然微生物群落所包括的菌种的大部分人类都了解甚少，所以对白酒发酵过程中天然微生物群落进行现场快速的结构组成定量还非常困难。目前常见的技术包括：

一是传统培养方法；比如窖泥中大部分微生物属于未培养菌，使用传统培养基培养窖泥微生物速度慢，鉴定工作量很大；

二是焦磷酸高通量测序方法；这是目前国内外流行的一种群落结构定量测定方法，一般通过生物技术公司委托服务来完成，价格昂贵，可以返回的测序个数高达几十万条，一般可以定性定量到属；

三是FISH技术；FISH即fluorescence in situ hybridization技术是基于碱基互补的原则，将一小段(通常15-30个碱基，比如16S rRNA片段)荧光标记的核酸序列作为探针，与载玻片上的目标样本杂交，与靶序列专一结合，通过检测杂交位点荧光来显示特定核苷酸序列的存在与数量；

四是DGGE/TGGE技术；DGGE即denatured gradient gel electrophoresis技术是由Fischer和Lerman 1979年最先提出用于检测DNA突变。Myers等1985年在DGGE中使用“GC夹板”和异源双链技术。Muzyer等1993年证实这种技术在研究微生物群落遗传多样性和种群差异方面非常有效。后来代替化学变性剂的温度梯度凝胶电泳(temperature gradientgel electrophoresis，TGGE)是衍生技术。DGGE/TGGE是依据双链DNA片断熔解行为的不同，分离PCR产物中长度相近但序列不同的DNA标记片断(rRNA或rDNA)。DGGE/TGGE图上的一个条带可代表一个微生物类群，分类水平可达种，可方便判断出优势菌或功能菌；

五是T-RFL技术；T-RFLP即Terminal-Restriction fragment length poly-morphism技术，是由RFLP发展而来。T-RFLP技术原理是将PCR一条引物标记荧光，将PCR扩增产物用限制性内切酶消化，产生不同长度的限制性片段，其中一部分含有荧光，形成T-RFLP图谱，揭示样品中微生物的种类、数量等信息；

六是RAPD技术；RAPD是一种DNA多态监测技术，通过PCR扩增，扩增产物经琼脂 糖凝胶电泳分离、溴化乙锭染色后，来检测DNA片段多态性。是一种对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。RAPD技术独特之处在于：1)模扳DNA的需量少，纯度要求低，采用随机引物；2)操作简便快速，不需分子杂交等步骤，直接进行DNA多态性分析；3)所需引物短，在整个基因组内的结合位点多，覆盖率大，引物可混用，可运用多种引物对基因组进行大面积的多态分析；4)检出率高。但RAPD结果重现性差；