[发明专利]一种区分蚕丝种类的检测方法

权利要求书

1.一种区分蚕丝种类的检测方法,其特征在于利用不同特征多肽制备蚕丝素蛋白特异抗体来在间接酶联免疫的方法中检测不同种类蚕丝的丝素蛋白成分，即将蚕丝素蛋白洗脱液包被到酶标板上，然后添加兔抗丝素蛋白抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物，洗涤后加入碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG抗体，洗涤加入底物显色液，底物被酶催化为有色产物，根据产物颜色变化的深浅可进行定性分析；

其中，根据桑蚕丝素蛋白和柞蚕丝素蛋白的氨基酸序列区别设计合成序列为“MQRKNKNHGILGKC”的多肽制备桑蚕丝素蛋白特异抗体，设计合成序列为“CSHSHSYEASRISVH”的多肽制备柞蚕丝素蛋白特异抗体；

具体检测步骤如下：

a)溶液的配制：pH为7.4的PBS缓冲液配制：KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.27g，NaCl 8.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g，用蒸馏水定容至1000mL；碳酸盐缓冲溶液配制：Na₂CO₃ 1.5g，NaHCO₃2.9g，用蒸馏水定容至1000ml；

封闭液配制：BSA0.1g，加pH为7.4的PBS缓冲液定容至10mL；

终止液配制：蒸馏水178.90mL，逐滴加入98％硫酸21.70mL；

b)将0.01g-0.1g样品溶解于100-1000mL pH为9.6的碳酸盐缓冲溶液中，混合搅拌均匀，静置，取50-120μl上清液加入到酶标板中，形成实验对照1、2；实验对照1在后续步骤添加兔抗桑蚕丝素蛋白抗体，实验对照2在后续步骤添加兔抗柞蚕丝素蛋白抗体；取50-120μl pH为7.4的PBS缓冲溶液作为空白对照1、2用，空白对照与实验对照相对应；阴性对照设为不加一抗，其包被液和实验对照设为一样；然后将各阴性对照，空白对照,实验对照各放置于4℃冰箱中过夜；

c)各孔中加入封闭液100-300μl，37℃下封闭1-2h，然后吸出孔内液体，用pH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min；

d)分别取用封闭液稀释1000-12000倍的兔抗桑蚕和柞蚕丝素蛋白多克隆抗体50-120μl，加入到酶标板中，保鲜膜封板，37℃下温育1-2h，然后吸出孔内液体，用pH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min；

e)各孔中加入用封闭液稀释3000-10000倍的碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG抗体50-120μl，37℃下温育1-2h，然后吸出孔内液体，用pH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤5次，每次3min；

f)各孔内加底物显色液100μl，置黑暗处使其反应10min；

g)各孔内加终止液50-120μl，终止反应；

h)将酶标板置于酶标仪中，读取吸光度数值；

i)比较实验组测得的OD值；

将空白对照的OD均值+3个SD作为cut-off值；

若实验对照1的OD均值＞空白对照1的cut-off值，则证明所检测的样品为桑蚕丝；

若实验对照2的OD均值＞空白对照2的cut-off值，则证明所检测的样品为柞蚕丝。