[发明专利]GC-MS联用技术评价6-BA对川西云杉愈伤组织发育影响的方法

权利要求书

1.GC-MS联用技术评价6-BA对川西云杉愈伤组织发育影响的方 法，其特征在于，包括以下步骤：用不同浓度6-BA培养基对川西云 杉愈伤组织进行继代培养，愈伤组织代谢组的萃取、干燥和衍生化， GC-MS检测，代谢组数据处理和标记代谢物的筛选。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，继代培养方法为： 将川西云杉的愈伤组织分别转接到1/2LM+10μM2,4-D+5μM 6-BA+0.2％植物凝胶，1/2LM+10μM2,4-D+3.6μM6-BA+0.2％植物 凝胶和1/2LM+10μM2,4-D+2.5μM6-BA+0.2％植物凝胶的培养基中 培养，每14d继代一次，培养3个月后，得到三种浓度6-BA处理的川 西云杉愈伤组织。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将用三种浓度6-BA 处理3个月后的川西云杉愈伤组织，在转接继代培养后第7天，用无菌 镊子从培养基上挑取，置于无菌滤纸上，吸取愈伤组织上的植物凝胶； 将100±0.5mg组织样品称重后，置于冻存管里，每个处理重复6次， 放入液氮中速冻2h后，放入-80℃冰箱中保存备用。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，愈伤组织代谢组的 萃取方法为：向保存的100±0.5mg组织样品中加入60μl核糖醇，漩涡 混匀；然后加入0.35mL甲醇，漩涡混匀，将研磨仪频率设定为70Hz 研磨5min，然后于70℃处理10min；接着将样品于4℃，12000rpm离 心10min；取上清，得到川西云杉愈伤组织的代谢组提取液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在真空浓缩器中干 燥川西云杉愈伤组织的代谢组提取液，获得干燥提取物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述衍生化方法为： 向干燥提取物中加入80μL甲氧胺盐试剂混匀，于37℃孵育2h；接着 向每个样品中加入100μLBSTFA试剂，将混合物于70℃孵育1h；最后 冷却至室温，获得用于GC-MS联用技术检测的川西云杉愈伤组织代谢 组样品；

其中，甲氧胺盐试剂为甲氧胺盐酸盐溶于吡啶中配制成浓度 20mg·mL^-1的溶液，BSTFA试剂为BSTFA和1％TCMS按体积比99:1配 制而成。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，GC-MS检测使用的 气相色谱仪为Agilent7890A，质谱仪为Pegasus4D；具体检测条件为： 30m×250μm×0.25μmDB-5MS毛细管柱；进样体积1μL；流速1 mL/min；进样口、传输线和离子源温度分别为280℃、250℃和220℃； 以氦气为载气，恒压模式；电离能量-70eV，全扫描模式下扫描范围 m/z20–600，采集速率100谱图/min，溶剂延迟时间492s，色谱柱梯 度升温程序参数如下：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，代谢组数据处理具 体如下：

(1)数据预处理：采用四分位间距法或四分位数极差对数据进 行过滤，以去除噪音数据；使用内标归一法对过滤后的数据进行标准 化处理；

(2)对预处理的数据进行主成分分析、偏最小二乘法-判别分析 后，结合S-plot和loading-plot从复杂的数据中判别出差异表达的标记 代谢物和潜在感兴趣的代谢物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述差异表达的标 记代谢物包括色氨酸，亮氨酸和丝氨酸。

10.与川西云杉愈伤组织发育能力相关的标记代谢物，其特征在 于，所述标记代谢物包括色氨酸，亮氨酸和丝氨酸。