[发明专利]具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株，其特征是，该细胞株的命名为大鼠肝癌细胞Wrh-f2，于2015年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCC2015174。

2.权利要求1所述具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）、取雄性Wistar大鼠，第1天按100mg/kg腹腔注射一次DEN；从第2天起，以每7天为一个循环单位，先连续五天给予含100ppm的NMOR饮水，任其自由饮用，然后连续两天给予无菌水，任其自由饮用；

（2）、第20周末，无菌条件下取肝脏肿瘤组织，切成0.5-1.0mm³大小的组织块，采用单层细胞培养法将组织块加入24孔板中进行培养，48h后半数换液，此后每3d换一次液；本步骤中所用培养基为含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基；

培养的第5d，肝癌细胞从组织块中爬出，培养的第14d行第1次传代，培养的第24d行第2次传代；

（3）、将培养24d的肝癌细胞所用培养基更换为无血清培养基并继续培养24h，然后使用胰酶进行消化，按1×10⁵个细胞/小室接种到成胶Transwell小室内，然后将小室放入24孔板，加入含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基，37℃、5%CO₂条件下培养24h后，取出小室，可见24孔板底有肝癌细胞生长；

所述成胶Transwell小室是将Matrigel和DMEM以体积比1∶4混合后加至Transwell小室内制成人工基质膜而得；

（4）、将步骤（3）中24孔板的板底肝癌细胞收集后，加含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基继续培养，待肝癌细胞长满，扩大培养至50mL培养瓶中；

（5）、取扩大培养的肝癌细胞，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基稀释至1个细胞/200μL，然后按200μL/孔加入96孔板进行克隆化培养，7d后取生长良好的单克隆细胞株，即为高转移潜能的大鼠肝癌细胞株。

3.权利要求1所述具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株在制备移植性肝癌模型中的应用。