[发明专利]一株高活性克拉维胺酸氨基乙酰化酶的棒状链霉菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物育种和生物技术领域，具体涉及一株高活性克拉维胺酸氨基乙酰化酶的棒状链霉菌及其应用。

背景技术

克拉维酸(clavulanicacid)是临床上常用的β-内酰胺酶抑制剂，可与阿莫西林或替卡西林联合用药，从而增强该抗生素对耐药菌株的抗菌活性，提高临床疗效，具有重要的临床价值。

克拉维酸是由棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)合成的一种次级代谢产物，工业生产方式为微生物发酵和提取精制。目前发酵水平是决定克拉维酸生产成本的重要因素，因此研发克拉维酸高产菌株具有非常重要的工业价值。野生型棒状链霉菌的克拉维酸产量很低，远远不能满足工业发酵的需要，所以现有的棒状链霉菌工业菌株都是通过多轮诱变筛选得到的突变株，但是常规诱变育种技术具有随机性和盲目性，导致育种工作效率较低，周期很长，成为制约发酵工业生产技术提高的一个瓶颈。开发一种高效的棒状链霉菌育种方法并获得高产菌株具有非常重要的实际应用价值。

克拉维胺酸氨基乙酰化酶是从中间体克拉维胺酸转向克拉维酸合成途径的关键酶，该酶活性提高时能够提高克拉维胺酸转向合成克拉维酸的催化效率，而酶活性降低时克拉维胺酸会流向副产物。通过对克拉维胺酸氨基乙酰化酶进行基因改造可以有望获得克拉维酸高产菌，但由于基因改造的位点难以选择，因此，目前尚未有关于对克拉维胺酸氨基乙酰化酶进行基因改造而获得克拉维酸高产菌的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株高活性克拉维胺酸氨基乙酰化酶的棒状链霉菌及其应用。采用定向进化的策略，对克拉维胺酸氨基乙酰化酶进行定向改造，并配合高通量筛选技术获得高活性克拉维胺酸氨基乙酰化酶，进而得到克拉维酸高产菌株。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的一个方面涉及一种高活性克拉维酸氨基乙酰化酶，其具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明的另一方面涉及编码上述高活性克拉维酸氨基乙酰化酶的基因；具体的，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明的再一方面涉及一种棒状链霉菌，其含有上述编码高活性克拉维酸氨基乙酰化酶的基因。

本发明的再一方面涉及一株高活性克拉维胺酸氨基乙酰化酶的棒状链霉菌，该菌株具体为棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)B02-246。已于2015年10月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNO.11484。

本发明的棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)B02-246与工业菌株棒状链霉菌B02相比，克拉维胺酸氨基乙酰化酶的基因有4个碱基发生改变，分别是第1222位由A变为G，第1229位由A变为T，第1239位由C变为A，第1240位由C变为G。其中第1222位碱基突变引起密码子由AAG变为GAG，氨基酸由赖氨酸变为谷氨酸；第1229位碱基突变引起密码子由GAC变为GTC，氨基酸由天冬氨酸变为缬氨酸；第1239位碱基突变引起密码子由CTC变为CTA，是同义突变，氨基酸没有变化，都是亮氨酸；第1240位碱基突变引起密码子由CAG变为GAG，氨基酸由谷氨酰胺变为谷氨酸。

本发明的另一目的是提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)B02-246。

所述棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)B02-246和/或所述菌剂在制备克拉维酸中的应用也属于本发明的保护范围。

进一步的，所述棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)B02-246和/或所述菌剂在制备β-内酰胺酶抑制剂中的应用也是本发明的保护范围。