[发明专利]重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法

权利要求书

1.一种重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，其特征在于以植物乳杆菌ZJQ基因组为模 板，PCR扩增plnD目的基因，将扩增得到的基因片段用PCR产物纯化试剂盒纯化特异性扩增 条带，将纯化后的PCR产物和质粒pNZ8048经NcoI和HindIII双酶切后纯化，16℃连接过夜， 得到重组质粒pNZ8048-plnD。

2.根据权利要求1所述的重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，其特征在于：所述PCR扩 增所用引物为：

上游引物：5'-CATGCCATGGCTTTGTTTCCAATTTATTTATACGA-3'；

下游引物：5'-CCCAAGCTTCTAGTTGTCTCTCAACAACTTAT-3'。

3.根据权利要求1所述的重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，其特征在于：所述PCR扩 增反应体系为：10×buffer(Mg²⁺)2μL，2.5mmol/LdNTPMixture1.6μL，10μmol/L上游 引物0.8μL，10μmol/L下游引物0.8μL，DNA模板1μL，rTaqDNAPolymerase0.2μL，其余为灭 菌超纯水，总体积为20μL；所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min；进入循环，95℃变性 30s，49℃退火50s，72℃延伸50s，31个循环；反应结束后72℃延伸10min，降温至4℃保存。

4.根据权利要求1所述的重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，其特征在于：PCR产物的 双酶切反应体系为：10×KBuffer4μL，plnDPCR产物30μL，NcoI2μL，HindIII2μL， ddH₂O2μL，总体积为40μL；pNZ8048的双酶切反应体系为：10×KBuffer4μL，pNZ8048质粒 30μL，NcoI2μL，HindIII2μL，ddH₂O2μL，总体积为40μL。

5.根据权利要求1所述的重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，其特征在于：所述过夜连 接的连接体系为：plnD酶切目的片段6μL，酶切质粒pNZ80482μL，10×T4DNALigase Buffer1μL，T4DNAligase1μL，总体积10μL。