[发明专利]一种冷冻保存液及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及冷冻保存，尤其是氧化石墨烯在生物材料冷冻保存中的应用，以及一种含有氧化石墨烯的冷冻保存液，该保存液的制备方法，和应用该保存液进行细胞、组织或器官冷冻保存的方法，属于生物材料冷冻保存技术领域。

背景技术

低温或者超低温保存技术是20世纪70年代迅速发展起来的一种在干冰或者液氮的条件下保存生物组织、器官和细胞等生物材料的技术。在低温条件下，生物组织处于“休眠的状态”，保证了生物材料的遗传和形态稳定性，是一种有效保存生物材料的方法。近几十年里，该项技术的应用集中在具有经济价值的哺乳类、禽类、鱼类等动物以及各种植物的研究领域。低温、超低温保存作为一项新兴技术，不仅促进了生物学、医学等基础学科的发展，也在农业、畜牧业、养殖业等领域发挥了极大的作用，产生了极大的经济效益。

然而，在复苏过程中，冷冻保存液中所含的冰晶会持续生长，而冰晶损伤是冷冻保存技术中对保存对象最主要的伤害，是由于抗冻保存液或细胞内的水分形成冰晶，刺伤细胞导致的。

冷冻技术领域目前已发展出了程序冷冻法和玻璃化冷冻法，其中后者利用高浓度的冷冻保护剂在超低温环境下凝固，形成不规则的玻璃化固体，不形成冰晶，从而使细胞在剧烈的快速降温中得到保护，来克服冰晶损伤，但是，玻璃化样品在复苏过程中依然会产生大量的冰晶。目前主要是通过调整冷冻保存液的组成，例如使用渗透性抗冻剂(如甘油、DMSO等)和非渗透性抗冻剂(如聚乙二醇、PVP等)，以及调控冷冻降温程式的方式，来尽量减少冰晶的形成。

氧化石墨烯是一种以重复不饱和六元碳环为骨架的两亲性二维材料，其表面分布着含氧官能团和完整石墨烯区域。氧化石墨烯可如同界面活性剂一般存在界面，并降低界面间的能量。目前氧化石墨烯在聚合物类复合材料以及无机物类复合材料领域的应用逐渐广泛起来。

发明内容

本发明的发明人研究发现，氧化石墨烯能稳定地分散在液体中，并且能抑制冷冻和/或复苏过程中冰晶的生长。在此基础上，本发明保护以下技术方案：

氧化石墨烯用于抑制冷冻保存液冷冻和/或复苏过程中冰晶的生长。优选所述的冷冻和/或复苏过程是生物材料的冷冻和/或复苏。

氧化石墨烯在制备冷冻保存液中的应用。优选所述的冷冻保存液是用于生物材料的冷冻保存。

一种冷冻保存的方法，其特征在于，在冷冻保存液中添加氧化石墨烯。优选所述的冷冻保存方法是生物材料的冷冻保存方法。

一种含有氧化石墨烯的冷冻保存液。

下面详细说明本发明所要保护的技术方案。

可用于本发明的“生物材料”包括但不限于：细菌，真菌，病毒，藻类，立克次体，螺旋体，来源于人体、动物和植物的细胞、组织、器官，以及通过生物工程技术获得的细菌、真菌、病毒、藻类、细胞和组织。总之生物技术及相关领域中所有能够冷冻保存，以及需要冷冻保存并复苏的生命材料都包涵在本发明“生物材料”的范畴内。在一些实施例中，生物材料可以是天然存在的细菌或者通过生物工程技术获得的工程菌，例如大肠杆菌、沙门氏菌、金黄葡萄球菌、链球菌、枯草芽孢杆菌等；在一些实施例中生物材料可以是来源于人体、动物和植物的细胞，或者通过细胞工程技术获得的工程细胞，例如动物或人体的肝细胞、生殖细胞、神经细胞、肌纤维细胞、上皮组织细胞，植物的根细胞、叶细胞，或者各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞，例如Hela细胞、SHG-44胶质瘤细胞、A549细胞等；在一些实施例中生物材料可以是来源于人体或动物的组织或器官，或者通过组织工程技术获得的组织，例如皮肤组织或皮肤工程组织、软骨组织、骨组织或骨工程组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织、肾脏、肝脏、角膜、心脏、肺等。在本发明的一些实施例中生物材料是造血干细胞，软骨组织，肾脏器官，三七的根细胞，皮肤工程组织，哺乳动物或人类的精子。

可用于本发明的“冷冻保存液”是在冷冻保存过程中用于悬浮生物材料的各种溶液，例如：10～50％的甘油，添加有甘油、DMSO、PVP或者聚乙二醇等抗冻剂的生理盐水、Hank’s液、DMEM培养液、RPMI-1640培养液或各类细菌培养基等，也可以是Hank’s液、DMEM培养液、RPMI-1640培养液或各类细菌培养基等。