[发明专利]一种他达那非及其结构类似物的人工抗原、抗体及其酶联免疫检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种他达那非及其结构类似物的人工抗原、抗体及其酶联免疫检测试剂盒。

背景技术

他达那非（tadalafil）是继西地那非的第二代FDA批准使用的用于治疗男性功能性勃起障碍的处方药，与西地那非一样均是PDE5抑制剂，相比于西地那非，他达那非具有药效持续时间长的优点。

他达拉非与西地那非一样都为非选择性PDE-5，在抑制PDE5的同时也会抑制PDE6，从而引起视觉和听力的损伤。且若过量服用则会引起头痛、消化不良，颜色分辨下降等不良反应，与硝酸酯类药物的共同服用时更会导致严重的低血压，甚至导致心悸猝死，故PDE-5药物一定要在医生的指导下服用。

但近年来发现，一些保健食品中尤其是天然的补肾壮阳保健品被一些不法商家人为的添加了PDE-5药物，若患有糖尿病、高血压，高血脂、冠心病等疾病的病人在服用硝酸酯类药物的同时又服用这些含有他达那非类PDE-5药物的保健品，将会导致不可预估的危害，因此对他达那非等PDE-5药物的检测的研究也尤其迫切和重要。

他达那非的检测目前最常用的方法为仪器分析法，沈志武等人用反相高效液相色谱法对胶囊中他达那非进行检测，检出限可以达到5 ng/L，王美玲等人采用高效液相色谱-离子阱飞行时间串联质谱法检测保健品中28种磷酸二酯酶-5抑制剂（PDE-5）及其类似物的含量，该方法的检出限为0.2～7.0μg/L。行标SN/T 1951-2007中采用液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）方法对出口食品中的他达那非进行检测。虽然上述几种仪器分析法的检测精确度高，但因其仪器化程度高、检测时间长、过程繁琐、检测费用昂贵等，从而阻碍了其推广应用，因而通常作为实验室确证方法，但是无法满足现场或者大批量的快速筛查检测。而免疫分析法因成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器化程度低，值得我们推广成为常用的筛选方法。目前关于他达那非的免疫分析方法鲜有报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中他达那非检测方法出现的上述缺陷，提供一种他达那非的人工半抗原。

本发明的第二个目的是提供一种他达那非的人工抗原。

本发明的第二个目的是提供他达那非的人工抗体。

本发明的第三个目的是提供上述他达那非的酶联免疫检测试剂盒。

本发明的的第四个目的是提供上述试剂盒的使用方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种他达那非半抗原，其结构式为：

。

申请人将氨基他达那非与多种物质结合，研究其免疫效果，结果表明当和顺丁烯二酸酐相结合制备半抗原后，利用所述半抗原制备抗原，具有优异的免疫效果。

本发明还提供式（I）所述化合物作为检测他达那非及其结构类似物的半抗原的应用，其特征在于，式（I）的结构式为：

（I）。

所述他达那非的结构类似物为正辛基他达那非、正丁基他达那非、羟丙基他达那非、环戊基他达那非、去甲基他达那非、乙酰他达那非、氨基他达那非。

本发明所述半抗原的制备方法，是按投料摩尔比为1：1～1.4将氨基他达那非和顺丁烯二酸酐置于反应器中，加入适量的DMF溶解，60～65℃水浴2～4h；将得到的反应物60～75℃旋转蒸发除去DMF；得到的残渣用乙酸乙酯溶解，再滴加正己烷进行重结晶，过滤收集沉淀即得。

氨基他达那非和顺丁烯二酸酐的投料比以及二者的反应温度显著影响获得半抗原的效果，必须要在上述范围内才能获得效果良好的半抗原。

本发明还提供一种他达那非人工抗原，由所述他达那非半抗原与载体蛋白偶联获得，其结构式为：

其中，Pro为载体蛋白，所述载体蛋白选自牛血清蛋白、人血蓝蛋白或卵清蛋白。

本发明所述的他达那非人工抗原的制备方法采用活泼酯法，具体步骤如下：

（1）将等摩尔的前述方法制备得到的他达那非半抗原、DCC、NHS溶解于DMF中，4℃反应过夜；

（2）将步骤（1）所得的反应物离心取上清液，将上清液加入到含有载体蛋白（牛血清蛋白、血蓝蛋白或卵清蛋白）的PBS缓冲液中，将混合物在4℃反应12 h；

（3）将步骤（2）中反应物装入到透析袋中，透析得到所述他达那非人工抗原。

本发明还提供所述他达那非人工抗原制备得到的他达那非抗体，包括他达那非单克隆抗体、多克隆抗体和基因工程抗体。