[发明专利]一种快速测定蝉花样品中多球壳菌素含量的方法

说明书

技术领域

虽然利用高效液相色谱(HPLC)可以较准确地检测出样品中多球壳菌素的含量，但是由于蝉花样品中多球壳菌素含量较低，譬如多糖、肽、氨基酸等其它一些复杂成分均会对其HPLC的检测造成较大干扰，故在进行HPLC前还需对蝉花提取液中的多球壳菌素进行分离纯化处理，从而导致整个实验步骤繁琐、耗时周期长，并且实验所需的仪器设备也较昂贵，上述这些因素都不利于检测蝉花中多球壳菌素技术的推广，最终也限制了更大地开发、利用蝉花市场价值的空间。

背景技术

蝉花(Cordycepscicadae)，又名蝉蛹草、蝉茸、冠蝉、胡蝉等，属虫生真菌，是我国传统的名贵中药材。它是由土中蝉的幼虫被虫草菌感染、寄生后死亡，真菌汲取幼虫尸体的营养从而形成的虫草菌丝体，当虫体内的菌丝体逐渐繁殖直至突破虫体长出类似花朵的“芽”，构成具有动、植物两种形态特征的虫体与菌丝复合体。由于蝉花在提高人体免疫力、抗疲劳、保肾、改善睡眠、抗肿瘤、保肝、抗辐射和明目等诸多方面均具有良好的效果，蝉花的药用价值和保健功效引起了人们的极大关注，当前市场上以蝉花为主要原料的药品及保健品也越来越多，多球壳菌素(Myriocin，ISP-1)作为蝉花中的重要活性成分，其含量的高低对于蝉花制品功效的发挥至关重要。同时蝉花中多球壳菌素的含量也可作为评判蝉花质量的标准。目前现有的检测蝉花中多球壳菌素的方法手段比较单一，主要是利用高效液相色谱(HPLC)对样品中的多球壳菌素含量进行检测。

发明内容

一种快速测定蝉花样品中多球壳菌素含量的方法，包括以下部分：

1、实验准备

(1)制备酵母YPD固体培养基

分别准确称取1g酵母提取物(yeastextract)、2g蛋白胨(peptone)、1.5g琼脂(agar)于250ml锥形瓶，加入90ml蒸馏水，用锡箔纸封口然后置于高压灭菌锅进行灭菌处理(121℃，20min)，待灭菌完成后再加入10ml已灭菌的20％D-葡萄糖(D-glucose)，最后趁热导入培养皿中，每个培养皿中20ml培养基，干燥后置于4℃冰箱待备用。

(2)制备酵母平板菌落

取BY4741(基因型：MATa；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0)酵母的甘油菌2μl于1ml灭菌去离子水中并混合，然后取100μl混合液于900μl灭菌去离子水中并混合，吸取50μl的最终混合液涂布在(1)制备的YPD平板上，置于30℃培养箱中1～2天，待平板上的酵母单菌落长出。(适宜稀释倍数需参照甘油菌浓度)。

(3)制备酵母SDC液体培养基

按照下表的组分准确称取所需物质并加去离子水定容至1000ml，搅拌均匀后调pH至6.0，最后使用0.22μm的滤膜进行抽滤灭菌。

(4)制备多球壳菌素对照品溶液

配制多球壳菌素对照品母液：精确称取1mg多球壳菌素对照品并溶于1ml95％乙醇，振荡均匀使药品完全溶解。

配制多球壳菌素工作液：按照下表所示梯度浓度稀释母液

(5)制备蝉花样品提取液

提取方法可以选择超声提取法、加热回流提取法、浸泡提取法等多种方法，此次选择浸泡提取法，即准确称取2g蝉花纯粉样品于50ml锥形瓶，加入20ml95％乙醇，摇荡混匀并置于空气恒温摇床中48h(200rpm，30℃)。然后将料液离心(8000rpm，5min)，转移所得上清液即为蝉花样品浸泡提取液。

(6)制备植物鞘氨醇(PHS)母液

精确称取0.0016g植物鞘氨醇粉末于1.5mlEP管，加95％乙醇定容至1ml，溶解完全后即得5mM的PHS母液。

2、实验步骤

1.从长有BY4741菌落的YPD平板上挑取5个单克隆于盛有2mlSDC培养基的灭菌锥形瓶，将瓶口用锡箔纸包裹以防染菌，在200rpm，30℃的条件下过夜培养至饱和；