[发明专利]基于DPO引物的实时荧光PCR检测鼠李糖乳杆菌的方法、引物及试剂盒

说明书

本发明提供了一种引物对，其中一条引物包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。本发明还提供了所述的引物对在制备检测鼠李糖乳杆菌的试剂盒中的用途以及基于DPO引物的实时荧光PCR检测鼠李糖乳杆菌的方法。本发明针对鼠李糖乳杆菌设计特异性DPO引物，建立了实时荧光PCR法，成功实现了种水平的鉴定，灵敏度高；本发明将SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR和DPO引物检测技术相结合，成功建立了一种特异性强、灵敏度高、具备定量能力的鼠李糖乳杆菌的检测方法；本发明的DPO引物和方法在不同实验室之间具有通用性；本发明将DPO引物和SYBR Green I的实时荧光PCR结合起来，检测结果易于判断，增强了本方法的实用性。

技术领域

本发明涉及菌株检测领域，特别涉及检测样品如微生物肥料、食品、医用益生菌制剂等中鼠李糖乳杆菌或者含有鼠李糖乳杆菌DNA的方法以及用于该方法的引物、含有该引物的组合物和试剂盒。

背景技术

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)是一种广泛使用的益生菌，具有维持肠道微生态平衡，提高机体免疫力等功效，目前已经被应用于食品、医用益生菌制剂等领域。近年来，该菌的功能不断被开发，目前鼠李糖乳杆菌已经应用在微生物肥料领域，对这些产品中微生物的准确鉴定是产品质量控制的重要依据，因此建立一种快速、准确的鉴定方法具有重要意义。

目前鼠李糖乳杆菌的检测主要依靠传统生理生化和分子生物学方法进行。

传统生理生化耗时耗力，而且由于乳杆菌属许多种非常相似，生理生化特征也存在许多相似之处，实际检测过程中难以判断，不能满足实际检测的需要。

基于特异性引物的PCR的方法具备快速、准确、低成本的优点，目前被广泛用于转基因、食源性微生物、医学病原菌等方面的检测。目前PCR法已经被应用于鼠李糖乳杆菌的检测，Kwon等建立用于检测鼠李糖乳杆菌的特异性引物，但需要另外一对引物将鼠李糖乳杆菌与干酪乳杆菌区分开；杨小红等建立了普通PCR法检测鼠李糖乳杆菌，并用40株标准菌株验证了方法的特异性，并将该特异性引物成功转化成为农业部标准NY/T 2066-2011。以往报道的特异性引物检测鼠李糖乳杆菌全部使用的是普通引物，需要严格控制反应条件尤其是退火温度，退火温度的变化可能会影响到引物的特异性，例如农业部标准NY/T 2066-2011中所使用的鼠李糖乳杆菌特异性引物以较高的退火温度(67℃)来保证引物的特异性。而不同实验室之间由于仪器、人员等差异，可能会无法精确重复出试验的各项条件，导致检测特异性受到影响，可能照成误判，而且普通PCR法需要进一步凝胶电泳判断结果，增加了检测所需时间。

实时荧光PCR中使用TaqMan探针能检测PCR中的特异性扩增产物，而不受非特异性扩增产物的影响，因此被广泛应用于微生物的定性及定量检测，但一条有效的荧光探针需要具备很高的保守性、合适的GC含量和长度、以及合适的Tm值等，而且不同乳杆菌之间的差异较小，这使探针设计的难度大大增加。另外，探针合成的价格比较昂贵，因而在一定程度上限制了特异性荧光探针的使用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、具备定量能力、通用性和实用性强的基于DPO引物的实时荧光PCR用于检测鼠李糖乳杆菌的方法，本发明还提供了用于该方法的DPO引物和含有该DPO引物的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

本发明提供了一种引物对，其中一条引物包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了所述的引物对在制备检测鼠李糖乳杆菌的试剂盒中的用途。

进一步的，本发明还提供了一种检测样品中鼠李糖乳杆菌的试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求1所述的引物对。