[发明专利]使用RIB7启动子下调基因表达的假囊酵母属的遗传修饰

说明书

本发明涉及在生物体中生产核黄素的方法，所述生物体被遗传修饰为用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的至少一个基因的天然启动子，所述方法包括在合适的培养基中生长所述生物体和从培养基分离核黄素。本发明还涉及属于假囊酵母属的被遗传修饰的生物体，以及这种遗传修饰的生物体在提高核黄素的累积中的用途。

发明领域

本发明涉及在被遗传修饰的假囊酵母属的生物体中生产核黄素的方法，所述遗传修饰是用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的至少一个基因的天然启动子，所述方法包括在合适的培养基中培养所述生物体和从培养基分离核黄素。本发明还涉及属于假囊酵母属的遗传修饰的生物体，以及这种遗传修饰的生物体在提高核黄素的累积中的用途。

背景技术

所有植物以及许多微生物都生产核黄素。核黄素是细胞代谢的重要组分，因为它充当黄素辅酶黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的前体，这两者是氧化还原反应中的重要电子载体并参与感光，DNA保护等。包括人类在内的高等真核生物不能合成核黄素，故而核黄素是以维生素(维生素B2)的状态获得的。人类的维生素B2缺乏导致口腔和咽部粘膜炎症，瘙痒和皮肤褶皱的炎症以及皮肤损伤，结膜炎，视力敏锐度减退和角膜混浊。在婴儿和儿童中，可能会出现生长抑制和体重减轻。因此，必须向人或动物膳食中补充核黄素。因而核黄素被添加到饲料和食品中并且也可以用作食品色素，例如在蛋黄酱或冰淇淋中。

核黄素可通过化学或生物技术生产。化学方法合成核黄素是基于使用例如D-核糖作为起始原料的多步骤过程。生物技术方法生产核黄素是基于几种微生物自然合成核黄素(特别是在合适的原料如植物油的存在下)的潜能。被称为核黄素生产者的微生物包括无名假丝酵母(Candida famata)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和假囊酵母属物种(Stahmann，2010，Industrial Applications，The Mycota X，第二版，Springer，Berlin，Heidelberg，第235-247页)。

特别地，假囊酵母属(先前的棉阿舒囊霉属(Ashbya)；属于酵母科(Saccharomycetaceae)家族)的丝状半子囊菌(hemiascomycete)真菌被鉴定为有效的核黄素生产者。在过去几年中，已对生产核黄素的物种棉假囊酵母(Eremothecium gossypii)进行了深入研究和分析，并且已对其基因组测序。

在棉假囊酵母(E.gossypii)中，发现核黄素生产阶段与几个核黄素生物合成基因(例如RIB基因RIB 1、2、3、4、5和7)的转录的强劲增加相关联。因此，例如通过整合另外的拷贝，已经开发出过表达这些基因的核黄素生产菌株，如在WO 95/26406或WO 99/61623中所概述的。

此外，已经阐明了假囊酵母属的核黄素生物合成途径(Fischer and Bacher(2005)Nat.Prod.Rep.22：324-350)。根据对生物合成途径的更佳理解，可通过过表达编码苏氨酸醛缩酶的GLY1(Monschau等人(1998)Appl.Environ.Microbiol.64(11)：4283-4290)以及破坏编码胞质丝氨酸羟甲基转移酶的基因SHM(Schlüpen等人(2003)Biochem J.369：263-273)来提高在假囊酵母属中的核黄素生产，这两者都干扰对生产核黄素是至关重要的GTP代谢(也参见图1和图2)(Stahmann，2010，Industrial Applications，The Mycota X，第二版，Springer，Berlin，Heidelberg，235-247)。发现经由干扰磷酸核糖胺合成来影响核黄素生产的再一个重要的调节基因是编码磷酸核糖基焦磷酸酰胺转移酶的ADE4，其可以被提供为反馈抗性版本(Jimenez等人(2005)Appl.Environ.Microbiol.71：5743-5751)。

然而，尽管有这些发展，但合成效率和生产的核黄素的量(特别是在假囊酵母属真菌的遗传背景下)仍非最佳，而对于食品级和饲料级核黄素的需求不断提高。